Внимание! Статья адресована врачам-специалистам

Huseynova R.G., Aliyeva H.M.

Azerbaijan Medical University, Baku

Formation of enterotoxigenic Escherichia coli biofilm isolated

in healthy and sick children

Резюме. Определение способности образования биопленки у детей с острым эшерихиозом, вызванным энтеротоксигенными штаммами Escherichia coli. Клинические изоляты E. coli с полирезистентностью к антибиотикам обладали более высокой способностью к образованию биопленок по сравнению со штаммами, чувствительными к большинству антибиотиков, и культурами, выделенными у здоровых детей. Штаммы кишечной палочки, чувствительные к большинству антибиотиков, были способны к образованию биопленок низкой плотности, в то время как штаммы E. coli с полирезистентностью к антибиотикам образовывали в основном биопленки средней и высокой плотности.

Ключевые слова: острый эшерихиоз, Escherichia coli, биопленка.

Медицинские новости. – 2023. – №6. – С. 66–69.

Summary. Diarrheagenic E. coli (DEC) is an etiological agent of childhood diarrhea. Diarrheal stool samples were obtained from children and E. coli were isolated and identified using standart guidelines provided for laboratory diagnosis of enteric pathogens. The main method for obtaining a pure culture is the bacteriological method. The greatest number of E. coli strains capable of forming biofilms was found among E. coli strains with multiple antibiotic resistance. Thus, clinical isolates of E. coli with multiple antibiotic resistance had a higher ability to form biofilms compared with strains sensitive to most antibiotics and cultures isolated from healthy children.

Keywords: acute escherichiosis, Escherichia coli, biofilm.

Meditsinskie novosti. – 2023. – N6. – P. 66–69.

Энтеротоксигенные E. coli – это название, данное группе кишечных палочек, которые вырабатывают экзотоксины, стимулирующие слизистую оболочку кишечника, заставляя его выделять избыточное количество жидкости, нарушая водно-солевой баланс и приводя к диарее (CDC).

Серотип возбудителя определяет клиническую картину эшерихиоза и состояние организма больного, которая весьма разнообразна. В остром периоде возможно развитие инфекционно-токсического шока, дегидратации III–IV степеней, острой почечной недостаточности [6].

Основные клинические признаки дифференцируются в зависимости от возбудителя. При эшерихиозах, вызванных энтеротоксигенными кишечными палочками, характерно холероподобное течение заболевания: острое начало, слабость, головокружение, нормальная или субфебрильная температура, тошнота, рвота, схваткообразные боли в животе, частый обильный водянистый стул.

Согласно классификации, диареегенные E. coli подразделяются по характеру возникновения болезни, способу зарождения заболевания на определенных стадиях, отдельным природным особенностям на две большие группы.

І группа – кишечная палочка, обнаруженная у младенцев и детей дошкольного возраста. Возбудителями инфекции в этой категории являются серологические кишечные палочки следующих групп: 020, 025, 026, 033, 044, 055, 086, 0111, 0119, 0125, 0126, 0127, 0128, 408, 197. Также имеется информация о возбудителях кишечной инфекции, которые относятся к О-группе. Это 015, 018, 077, 0114, 0117, 0142 и другие. Согласно последним данным, эти серовары еще не являются до конца изученными и их свойства с точки зрения этиологии и эпидемиологии нужно всячески развивать и анализировать.

ІІ группа – дизентерийные и холероподобные возбудители, обнаруженные у взрослого поколения и детей. Возбудителями инфекции в этой категории являются серологические кишечные палочки следующих групп: 025, 028, 032, 0112ас, 0115, 0124, 0129, 0135, 0136, 0143, 0144, 0151, 0152 (инфекции дизентерийных палочек), а также 01, 06, 015, 025 (301 серотип), 078, 0112ав (холероподобные возбудители) [19].

Важность проблемы бактериальных кишечных инфекций состоит также в частоте возникновения отдаленных постинфекционных осложнений в виде поражений нервной системы, синдрома раздражения кишечника, холецистита и др., развивающихся у 5–36,2% больных после перенесенной острой кишечной инфекции [18].

Исследования механизмов развития инфекционного процесса, включая образование персистирующих форм микроорганизмов, не могут не учитывать наличия особого биологического явления – формирования бактериальных биопленок [3, 13]. По некоторым данным, более чем в 90% случаев инфекционных заболеваний возбудитель образует биопленки [9], нахождение в которых обеспечивает микроорганизмам значительные преимущества по сравнению с изолированными клетками [8]. Формирование биопленок в очаге воспаления ведет к хронизации инфекционного процесса и сопровождается неудовлетворительными результатами терапии. Наиболее актуальные виды бактерий, образующие биопленки при инфекциях, – Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Actinomyces spp., Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus spp., представители семейства Enterobacteriaceae [11, 17].

Биопленки являются формой микробных сообществ, фиксированных на различных абиотических и биотических поверхностях. В природе они распространены повсеместно и состоят из микробных клеток и внеклеточного матрикса. Изучение биопленок в настоящее время вызывает огромный интерес исследователей, так как этот способ существования микроорганизмов создает большие проблемы для фармацевтической, медицинской, ветеринарной практики [1]. Например, бактерии в биопленках могут обмениваться плазмидами резистентности к препаратам, а также они не поддаются воздействию иммунной системы хозяина [8]. Микроорганизмы в биопленках создают свои «государства», где они живут и размножаются, а при благоприятных условиях выходят в организм, способствуя новому витку заболевания. Представления о биопленках, подтвержденные с помощью современных методов визуализации, изменили взгляды на заболевания в целом. Согласно последним исследованиям, хронические инфекции принципиально отличаются от острых, а существование биопленок при хронических инфекциях требует совершенно новых подходов к их лечению [9].

Хотя к настоящему времени считается доказанной роль микробных биопленок в развитии и хронизации многих инфекционных заболеваний, их значимость в развитии острого эшерихиоза, обусловленного ЭТКП с полирезистентностью к антибиотикам, не изучена [4].

Для борьбы с биопленками разрабатывают новые подходы к изучению их идентификации, новые антибиотики, способные проникать и эффективно действовать внутри биопленки, ведут поиск ингибиторов образования биопленки. Исследованию влияния факторов различного генеза на биопленкообразование как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов посвящено значительное количество работ [12, 14, 15, 18].

Биопленка усложняет лечение многих заболеваний и вызывает осложнения. Поэтому эта проблема обсуждается на конференциях, а информация о применении антибиотиков постоянно обновляется. Повышение резистентных штаммов создает проблемы нарушения микробиоза, что приводит к патологическим процессам, таким как кандидоз, аллергия и дисбактериоз, наряду с ослаблением эффективности лечения. По этой причине увеличивается количество исследований по разработке подходов к антибиотикам с альтернативными системами лечения.

Поскольку эфирные масла растительного происхождения обладают антибактериальным действием, исследования в этом направлении играют важную роль в решении проблемы. В связи с нарастанием проблемы резистентности возникает необходимость увеличения арсенала противомикробных препаратов и поиск новых терапевтических источников.

Современное направление медицины – наномедицина (изучение свойств металлов в форме наночастиц) – открывает перспективы в создании новых противомикробных средств. В настоящее время активно обсуждают возможность использования солей и оксида алюминия в медицине и фармацевтике [1, 10].

Однако влияние эфирных масел растительного происхождения, а также действие наночастиц на процессы формирования микробных биопленок недостаточно изучены.

Лечение хронических инфекций в настоящее время уже не может основываться на традиционной концепции микробиологии. Новые представления о биопленках требуют разработки антимикробных препаратов нового поколения.

Материалы и методы

Было обследовано 30 практически здоровых детей в возрасте от 1 до 5 лет и 210 детей с острым эшерихиозом среднетяжелого и тяжелого течения, обусловленным энтеротоксигенными штаммами E. coli. Пациентов дифференцировали на 5 групп.

I группа – практически здоровые дети.

Среди больных выделили 4 группы в зависимости от степени тяжести клинического течения, чувствительности возбудителя к антибиотикам и сопутствующей условно патогенной микобиоты:

– II группа – дети с моноинфекцией, средней степенью тяжести течения заболевания и чувствительностью к большинству антибиотиков;

– III группа – с тяжелым течением инфекции, чувствительны к большинству антибиотиков;

– IV группа – с тяжелым течением заболевания и множественной резистентностью к антибиотикам;

– V группа – с тяжелым течением эшерихиоза, сопровождающегося дисбиозом кишечника с избыточным ростом C. albicans.

Свойство образовывать биопленки определяли способом адгезии к полистеролу, считающемуся «золотым стандартом» среди методов определения биопленкообразования [2]. Суточные культуры, выращенные на сердечно-мозговом бульоне с добавлением 2% глюкозы, вносили по 0,2 мл в лунки планшет в 4 повторах, планшеты инкубировали в течение 18 при 37 ^оС, после чего жидкую фазу убирали, осадок адгезировавших клеток троекратно промывали ФФБ и затем окрашивали 1% спиртовым раствором кристалл-виолета, инкубировали в течение 45 минут, затем краситель убирали. Лунки трижды промывали дистиллированной водой, добавляли по 0,2 мл этилового спирта для экстрагирования избытка красителя, выдерживали 45 минут при комнатной температуре. Затем определяли оптическую плотность осадка при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали пустую лунку планшета. Значения ОП менее 0,5 расценивали как слабую способность к образованию биопленок, от 0,5 по 1,0 – как среднюю, при оптической плотности свыше 0,1 – как высокую.

Результаты и обсуждение

Мы провели сравнительное исследование способности образовывать биопленки штаммами E. coli, полученными у здоровых детей и выделенными от обследуемых нами детей с острым эшерихиозом. Результаты исследований представлены в таблице.

Таблица. Образование биопленок штаммами E. coli, полученными от практически здоровых детей и от разных групп больных

 Примечание: OD – оптическая плотность.

В штаммах, полученных у 30 здоровых детей, способность к образованию биопленок обнаружена только у 3 штаммов, что составляло 15±8,2%, при этом данный признак у всех 3 штаммов был слабо выражен.

Среди штаммов E. coli, чувствительных к большинству антибиотиков, выделенных от больных II и III групп, отмечено частое отсутствие способности образовывать биопленки соответственно 56,7±9,2 и 46,9±9,0% (t=0,76; p>0,05). Образование биопленок обнаружено у штаммов от пациентов II группы в 43,3±9,3% случаев, у культур, полученных от больных III группы, – в 53,1±9,0% (t=0,76; p>0,05).

Наибольшее количество штаммов кишечной палочки, способных образовывать биопленки, обнаружено среди штаммов кишечной палочки с множественной резистентностью к антибиотикам. Так, у E. coli, полученных от детей IV группы, это свойство было выявлено в 89,3±5,9% случаев, от детей группы V – у 88,5±6,4% штаммов (t=0,11; p>0,05). Отсутствие свойства образовывать биопленки у этих двух групп выявлено в единичных случаях.

Отсутствие существенных различий в образовании биопленок между штаммами кишечной палочки, полученными от детей групп IV и V, свидетельствовало, что дисбиоз кишечника с повышенной пролиферацией С. albicans не оказывал влияния на свойство выделенных штаммов E. coli образовывать биопленки.

Обращал на себя факт различия в интенсивности биопленкообразования. Если штаммы кишечной палочки от больных групп II и III в большинстве случаев были способны к образованию биопленок малой плотности, то штаммы E. coli с множественной резистентностью к антибиотикам образовывали преимущественно биопленки средней и высокой плотности.

Заключение

Таким образом, клинические изоляты E. coli с полирезистентностью к антибиотикам обладали более высокой способностью к образованию биопленок по сравнению со штаммами, чувствительными к большинству антибиотиков, и культурами, выделенными у здоровых детей. В последнее время этой форме существования микроорганизмов, способных образовывать биопленки, при инфекционной патологии отводится особое внимание. Это связано с установлением факта, что свойства микроорганизмов в составе биопленок существенно меняются по сравнению с теми же микробами, находящимися в планктонном состоянии.

Заболевания, связанные с образованием микробных биопленок, особенно трудны для лечения, характеризуются высокой частотой рецидивов и бактерионосительства, в части случаев могут являться причиной смертельных исходов [16].

Микроорганизмы, находящиеся в составе биопленок, существенно меняют свои физиологические характеристики. В биопленке существует единая генетическая система в виде кольцевых ДНК-плазмид, обеспечивающих поведенческий код для всех особей сообщества, входящего в состав биопленки.

Биопленки обеспечивают микробам большую стабильность и устойчивость для выживания в соответствующей экологической нише.

По другим данным, клинические изоляты E. coli часто образовывали биопленки – 10 из 14 штаммов [6]. При этом, к сожалению, авторы не указывают источники выделения и серогруппы изученных штаммов кишечной палочки, а также их чувствительность к антибиотикам.

Среди штаммов кишечной палочки с полирезистентностью к антибиотикам обнаружено наибольшее количество штаммов кишечной палочки, способных образовывать биопленки. У штаммов E. coli, выделенных от детей IV и V групп, биопленкообразование выявлялось в 1,7 раза чаще по сравнению со штаммами, выделенными от больных III группы, и в 2,1 раза чаще, чем у штаммов, полученных от больных группы II.

Другими авторами также показано, что среди штаммов семейства Enterobacteriaceae 59,2% культур были способны образовывать биопленки, а среди штаммов, продуцирующих бета-лактамазы широкого спектра действия и AmpC-лактамазы, в 91% были способны к биопленкообразованию [16].

При исследовании уропатогенных штаммов E. coli также было показано, что культуры с множественной резистентностью к антибиотикам обладают наиболее выраженными свойствами формировать биопленки [15].

Кроме того, по нашим данным, имели место различия в интенсивности биопленкообразования. Штаммы кишечной палочки, чувствительные к большинству антибиотиков, были способны к образованию биопленок низкой плотности, в то время как штаммы E. coli с полирезистентностью к антибиотикам образовывали в основном биопленки средней и высокой плотности.

Это согласуется с данными других авторов. При исследовании биопленок, образованных кишечными палочками, выявлено, что штаммы E. coli, синтезирующие бета-лактамазы широкого спектра, образуют более плотные биопленки по сравнению со штаммами, не способными продуцировать эти ферменты [7].

В то же время мы не выявили существенных различий в способности образовывать биопленки между штаммами, полученными от больных группы IV и V, что расценено нами как отсутствие влияния дисбиоза кишечника с повышенной пролиферацией С. albicans на свойство выделенных штаммов E. coli образовывать биопленки.

Показано, что энтеротоксигенные кишечные палочки в 77,4% случаев вызывают образование плотных биопленок, что является косвенным подтверждением полученных нами результатов [7].

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Анганова Е.В. Условно-патогенные энтеробактерии: доминирующие популяции, биологические свойства, медико-экологическая значимость// Автореф. дис…д-ра биол. наук. – Иркутск, 2012. – 34 с.

2. Жильцов И.В., Семенов В.М. // Военная медицина. – 2011. – №4. – С.40–44.

3. Климентова Е.Г. // Весн. Оренбургского гос. ун-та. – 2013. – №6 (155). – С.164–168.

4. Макарова М.А., Кафтырева Л.А. // Молекулярная диагностика. – 2017. c Т.2, раздел 20. – С.334–335.

5. Maнсурова Х.T., Байрамлы Р.Б., Гурбанова С.Ф., Месимов M.O. // Львивський нац. мед. ун-т им. Данилы Галицького ПП «ПМ». – 2011. – Т.XVII, №4. – С.147–154.

6. Никольская В.А., Данильченко Ю.Д., Меметова З.Н. // Серия «Биология, химия». – 2013. – Т.26, №1. – C.153–160.

7. Нечаева О.В., Аль-Баяти Б.М., Глинская Е.В. [и др.] // Известия Самарского научного центра Рос. академ. наук. – 2016. – Т.18, №2 (3). – С.776–782.

8. Семенов В.М., Жильцов И.В., Дмитраченко Т.И. [и др.] // Вестн. ВГМУ. – 2014. – Т.13, №4. – С.84–89.

9. Сулейманова Т.Х., Мурадова С.А., Караев З.О. // Проб-лемы медицинской микологии. – 2009. – Т.11, №2. – С.44-47.

10. ?liyev M.H. Bakterial m?ns?li bag?rsaq infeksiyalar?n?n mikrobiologiyas?. – Bak?, 2010. – 134 s.

11. Cicek Copur A., Saral A., Ozad Duzgun A., et al. // J. Antibiot. (Tokyo). – N66. – P.647–650.

12. Karaiskos I., Giamarellou H. // Expert Opin. Pharmacother. – 2014. – Vol.15, N10. – P.1351–1370.

13. Karaoglan I., Zer Y., Süner A., Nam?duru A. // ANKEM. – 2008. – Vol.22, N4. – P.183–187.

14. Król J.E., Wojtowicz A.J., Rogers L.M., et al. // Plasmid. – 2013. – Vol.70, N1. – P.110–119.

15. Mansurova H.T., Qarayev Z.Ö., // Az?rbaycan t?bab?tinin müasir nailiyy?tl?ri. – 2011. – N4, 2011. – S.127–132.

16. Shrestha R., Khanal S., Poudel P., et al. // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. – 2019. – Vol.18, N1. – P.42.

17. Qarayev Z.Ö., Bayramov R.B. Tibbi mikrobiologiya, immunologiya v? klinik mikrobiologiya. – Bak?, 2011. – 756 s.

18. Qarayev Z.Ö., Bayramov R.B. Genisl?nmis spektrli beta-laktamaza (GSBL) ?m?l? g?tir?n bakteriyalar?n klinikada yaratd?g? probleml?r / Professor ?.T. Agayevin anadan olmas?n?n 65 illiyin? h?sr olunmus elmi konfrans?n materiallar?. – Bak?, 2009. – S.242–245.

19. Qarayev Z.Ö., Qurbanov A.I. Tibbi mikrobiologiya v? immunologiya. – Bak?, 2010. – 860 s.

Медицинские новости. – 2023. – №6. – С. 66-69.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.