Внимание! Статья адресована врачам-специалистам
Lyudmila Kazeko, PhD, Associate Professor, Head of the 1st Department of Therapeutic Dentistry of the Belarusian State Medical University, Minsk
Victoria Zakharova, PhD, Associate Professor of the Department of Pathological Anatomy of the Belarusian State Medical University, Minsk
Elena Anfinogenova, PhD, Associate Professor of the Department of Pathological Anatomy of the Belarusian State Medical University, Minsk
Evgeny Cherstvy, MD, Professor of the Department of Pathological Anatomy of the Belarusian State Medical University, Minsk
Role of matrix metalloproteinase 1 in the forecasting of the periodontal pathology
Цель. Установить значение матриксной металлопротеиназы 1 (ММП-1) для дифференциальной диагностики различных форм периодонтитов на этапе манифестации заболевания путем морфометрической оценки характера ее экспрессии в биопсийном материале десен.
Объекты и методы. Проанализирован биопсийный материал десен 30 пациентов с признаками быстропрогрессирующего (n=6), хронического простого (n=7) и хронического сложного (n=17) периодонтитов. Морфометрический и статистический анализ экспрессии ММП-1 выполнен с использованием Aperio ImageScope v12.4.0.5043 и STATISTICA 10.0 соответственно.
Результаты. Экспрессия ММП-1 выявлена во всех проанализированных наблюдениях патологии периодонта в виде мембранного и цитоплазматического окрашивания эпителиальных клеток, фибробластов, клеток воспалительного инфильтрата и эндотелия собственной пластинки десны. При этом установлена прямая взаимосвязь позитивности и интенсивности эпителиальной и стромальной экспрессии ММП-1 между собой, а также характером и выраженностью воспаления, в том числе альтеративными изменениями эпителия и межэпителиальных лимфоцитов. Анализ характера экспрессии ММП-1 как изолированно в стромальном компоненте, так и комплексный анализ характера иммуногистохимического окрашивания в стромальном и эпителиальном компонентах десны выявил статистически значимо более высокие показатели позитивности и интенсивности экспрессии ММП-1 в группе быстропрогрессирующего периодонтита по сравнению с хроническими формами патологии периодонта, которые, в свою очередь, между собой по характеру экспрессии названного выше маркера значимых различий не имели.
Заключение. Проведенный анализ характера экспрессии ММП-1 в биопсийном материале десен пациентов с патологией периодонта показал, что все изученные показатели могут быть использованы для дифференциальной диагностики различных форм периодонтитов. Однако наиболее информативным с точки зрения определения прогноза течения заболевания является доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью, которая в группе быстропрогрессирующего периодонтита практически вдвое превышает таковую в группах хронического простого и сложного периодонтитов и ассоциирована с выраженностью воспалительной инфильтрации и альтеративными изменениями эпителия.
Ключевые слова: периодонтит, матриксная металлопротеиназа 1, иммуногистохимия, экспрессия, прогноз.
Современная стоматология. – 2020. – №2. – С. 83–88.
Objective. The purpose of the work is to establish the value of MMP-1 for the differential diagnosis of various forms of periodontitis at the stage of disease manifestation by morphometric assessment of the nature of its expression in the biopsy material of the gums.
Objects and methods. Biopsy material of the gums of 30 patients with signs of rapidly progressive (n=6), chronic simple (n=7) and chronic complex (n=17) periodontitis was analyzed. Morphometric and statistical analysis of MMP-1 expression was performed using Aperio ImageScope v12.4.0.5043 and STATISTICA 10.0, respectively.
Results. Expression of MMP-1 was detected in all analyzed observations of periodontal pathology in the form of membrane and cytoplasmic staining of epithelial cells, fibroblasts, inflammatory infiltrate cells and endothelium of the gum plate. At the same time, a direct relationship was found between the positivity and intensity of the epithelial and stromal expression of MMP-1 among themselves, as well as the nature and severity of inflammation, including alterative changes in the epithelium and interepithelial lymphocytes. Analysis of the nature of MMP-1 expression both in isolation in the stromal component and a comprehensive analysis of the nature of immunohistochemistry staining in the stromal and epithelial components of the gum revealed statistically significantly higher rates of positivity and intensity of MMP-1 expression in the group of rapidly progressive periodontitis compared with chronic forms of periodontal pathology, which, in turn, did not have significant differences between themselves by the nature of the expression of the aforementioned marker.
Conclusion. The analysis of the expression pattern of MMP-1 in the biopsy material of the gums of patients with periodontal pathology showed that all the studied parameters can be used for differential diagnosis of various forms of periodontitis. However, the most informative from the point of view of determining the prognosis of the course of the disease is the proportion of pixels with high and moderate intensity, which in the group of rapidly progressive periodontitis is almost twice that in the groups of chronic simple and complex periodontitis and is associated with the severity of inflammatory infiltration and alternative changes in the epithelium.
Keywords: periodontitis, matrix metalloproteinase 1, immunohistochemistry, expression, prognosis.
Sovremennaya stomatologiya. – 2020. – N2. – P. 83–88.
Периодонтит представляет собой воспалительное заболевание бактериального происхождения, приводящее к прогрессирующему разрушению опорных тканей зуба. Периодонтит возникает в результате сложных взаимодействий между периопатогенными бактериями, иммунной системой человека и факторами окружающей среды. Основная причина развития – инфекционное поражение тканей, а также индуцированная микроорганизмами иммунная и воспалительная реакции организма человека.
Первоначальный ответ хозяина включает врожденное распознавание комплекса микробных липополисахаридов клетками хозяина и последующую продукцию медиаторов воспаления, таких как эйказаноиды, активные формы кислорода, хемокины, цитокины и матриксные металлопротеиназы (ММП). Среди этих факторов ключевыми ферментами деградации и ремоделирования внеклеточного матрикса являются ММП, получившие свое название за способность специфически гидролизовать основные его белки. Сегодня описано около 30 различных ММП, обладающих схожими свойствами и различающихся по субстратной специ-фичности и структурной организации [1].
Матриксная металлопротеиназа 1 (ММП-1, интерстициальная коллагеназа, коллагеназа 1) была первой MMП, идентифицированной учеными Gross и Lapiere в 1962 году [12]. Свое название получила из-за способности расщеплять коллаген I типа. Продуцируется, в основном, фибробластами, но может экспрессироваться макрофагами, кератиноцитами, остеобластами, хондробластами, эндотелиальными клетками, моноцитами, некоторыми опухолевыми клетками. ММП-1 секретируется в латентной форме 52 kDa и конвертируется в форму с молекулярной массой 42 kDa, активация происходит с помощью ММП-2 или ММП-7. Синтез MMП?1 стимулируется различными агентами, например, эпидермальным фактором роста, цитокинами и фактором некроза опухолей альфа (TNF?-?), а также некоторыми химическими соединениями [9, 12, 14, 15]. Активированная ММП-1 расщепляет коллагены I, II, III, VII, VIII, X типа, желатин, казеин, агрекан, внутриклеточные протеины. ММП-1 (наряду с ММП-2) участвует в ремоделировании внеклеточного матрикса периодонта. Действие MMП?1 тормозится тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIMP?1 и -2), а также ?2?макроглобулином [5]. MMП-1 также может активировать MMP-2 и -9, инициируя каскад активации.
Проведенные клинические исследования подтверждают роль ММР-1 в развитии болезней периодонта. Так, при хроническом гингивите и периодонтите общие уровни MMP-1 и MMP-9 в десневой жидкости повышаются, по сравнению с таковыми у здоровых лиц, лечение приводит к снижению содержания этих MMP (p<0,05). При периодонтите у подростков 14–17 лет выявлено увеличение количества ММР-1 в десневой жидкости в сравнении с таковым в контроле [3, 7, 8, 11, 13].
Результаты исследования A.S. Ertugrul и соавт. (2013) позволили предположить, что повышенные уровни MMP-1 и MMP-9 и пониженные уровни TIMP-1 в десневой жидкости и в тканях десны пациентов с плоским лишаем в сочетании с плохой гигиеной полости рта способствуют усилению деструкции тканей периодонта [6].
Также есть достоверные доказательства того, что уровни MMP-1 и MMP-9 положительно коррелируют с такими клиническими параметрами, как десневой и периодонтальный индексы, глубина зондирования, потеря эпителиального прикрепления [2, 4, 10].
Цель работы – установить значение ММП-1 для дифференциальной диагностики различных форм периодонтитов на этапе манифестации заболевания путем морфометрической оценки характера ее экспрессии в биопсийном материале десен.
Объекты и методы
Критериями включения в исследование явились клинико-рентгенологические признаки деструкции периодонта и возраст пациентов, который составил для быстропрогрессирующего периодонтита 18–35 лет, для хронического (простого и сложного) периодонтита – 36–60 лет.
Клинико-инструментальное и лабораторное обследование и лечение пациентов выполнено на базе 1-й кафедры терапевтической стоматологии Белорусского государственного медицинского университета в Республиканской клинической стоматологической поликлинике и включало следующие этапы.
1) Оценка гигиены полости рта (OHI-S), тяжести воспаления десны (GI), определение глубины зондирования периодонтальных карманов и утери прикрепления (LA), рецессии десны, поражения фуркации, патологической миграции зубов, их подвижности, наличия окклюзионной травмы.
2) Выполнение общего и биохимического анализа крови, анализа крови на тиреоидные гормоны и остеоденситометрия для исключения соматической патологии, способной оказать влияние на состояние периодонта (при быстропрогрессирующем процессе).
3) Панорамную рентгенографию и компьютерную томографию для оценки уровня и характера резорбции костной ткани.
Всем пациентам проводили профессио-нальную гигиену и закрытый кюретаж, во время которого выполняли биопсию ткани десны с последующим морфологическим исследованием на кафедре патологической анатомии Белорусского государственного медицинского университета.
Проанализирован биопсийный материал 30 пациентов с признаками быстропрогрессирующего (n=6), хронического простого (n=7) и хронического сложного (n=17) периодонтитов. Морфологическое исследование включало оценку наблюдений групп патологии периодонта при стандартном окрашивании патогистологических препаратов гематоксилином и эозином и с использованием иммуногистохимического (ИГХ) метода с моноклональными антителами к ММП-1.
Отработка протокола ИГХ окрашивания включала подбор оптимального режима демаскировки антигена (2’ в буфере pH=9,0 при температуре 125 °С в нагреваемой барокамере Pascal), разведения первичных моноклональных антител к ММП-1 (1:100), визуализирующей системы, времени экспозиции хромогена 7’. В качестве хромогена использовали диаминобензидин (DAKO, Дания), контрокрашивание – гематоксилином Майера. Позитивным контролем являлись ткани и органы, рекомендованные производителем, негативным – исключение первичного антитела.
Для морфометрического анализа выполняли сканирование препаратов, окрашенных с использованием ИГХ метода, с применением цифрового слайд-сканера MoticEasyScan c последующим программным анализом изображений с использованием Aperio ImageScope v12.4.0.5043. В рамках программного анализа изображений проводилось выделение 4–6 случайных непересекающихся полей зрения (цифровое увеличение х8), с анализом ИГХ окрашивания в поле зрения в целом (которое включало эпителиальный и стромальный компонент в равных пропорциях), а также отдельно в стромальном компоненте десны. В процессе программного анализа экспрессии ММП-1 в ткани десны интенсивность ИГХ окраски измерялась Aperio ImageScope автоматически и разделялась на 4 уровня интенсивности: 0–100 (выраженная, соответствующая очагам красного цвета), 101–175 (умеренная, с программным окрашиванием соответствующих участков в оранжевый цвет), 176–220 (слабовыраженная, соответствующая участкам желтого цвета) и более 220 (негативная реакция, визуализируемая в виде участков синего цвета) (рис. 1). Цифровой результат программной оценки интенсивности экспрессии имел обратную взаимосвязь с данными визуальной оценки.
Для анализа исследуемых групп по характеру экспрессии ММП-1 с использованием программы Aperio ImageScope v12.4.0.5043 рассчитывали следующие параметры (х8): позитивность (отношение числа позитивных пикселей к общему числу позитивных и негативных пикселей х 100%); долю пикселей с высокой и умеренной интенсивностью (отношение числа позитивных пикселей с высокой и умеренной интенсивностью к общему числу позитивных и негативных пикселей х 100%); общий индекс интенсивности ИГХ реакции (отношение суммы интенсивностей позитивных и негативных пикселей к общему числу позитивных и негативных пикселей).
Статистический анализ данных проводили с использованием программного обеспечения STATISTICA 10.0 с вычислением медианы (Ме), интерквартильного (25% и 75% процентили) и 95% доверительного интервалов (ДИ), максимального и минимального значения. Для оценки характера распределения полученных данных использовали критерий Шапиро – Уилка (W). Сравнение независимых выборок по количественным признакам осуществляли с использованием дисперсионного анализа непараметрических данных ANOVA и определением критериев Краскела – Уоллиса (Н-критерий) для 3 выборок и более и Манна – Уитни (U-критерий) с целью парного сравнения выборок. Корреляционные взаимосвязи между анализируемыми признаками вычисляли с использованием рангового коэффициента корреляции непараметрических данных Спирмена (?). Уровень статистической значимости устанавливали р<0,05.
Результаты и обсуждение
При проведении морфологической оценки биопсийного материала десны пациентов с различными формами патологии периодонта оценке подлежали признаки альтеративных изменений в эпителиальном компоненте в виде десквамации эпителия, гидропической дистрофии, изъязвления, акантоза, наличия межэпителиальных лейкоцитов; наличие разрушения или гипертрофии коллагеновых волокон, кровоизлияний, воспалительной инфильтрации с преобладанием сегментоядерных лейкоцитов и/или мононуклеарной инфильтрации в сосочковом и сетчатом слое десны. При этом статистически значимых различий между выделенными группами периодонтитов выявлено не было.
Экспрессия ММП-1 в группах пациентов с различными формами периодонтитов выявлялась в виде мембранного и цитоплазматического окрашивания эпителиальных клеток, клеток воспалительного инфильтрата, фибробластов и эндотелиальных клеток собственной пластинки десны. При этом выявлена прямая (от умеренной до высокой) взаимосвязь позитивности и интенсивности эпителиальной и стромальной экспрессии ММП-1 между собой, а также с наличием эрозирования и выраженностью межэпителиальной инфильтрации лейкоцитами, р<0,05.
При визуальной оценке гистологических препаратов (рис. 2) экспрессия ММП-1 в группе быстропрогрессирующего периодонтита характеризовалась более выраженным окрашиванием стромального компонента десны по сравнению с группами хронического простого и сложного периодонтитов с преобладанием экспрессии в клетках воспалительного инфильтрата, фибробластах и эндотелии собственной пластинки десны.
Согласно результатам морфометрического анализа (рис. 2, 3), экспрессия ММП-1 во всех изученных группах перио-донтитов соответствовала умеренно и слабовыраженному ИГХ окрашиванию с наибольшей вариабельностью общей позитивности от 49 до 98% в группе хронического сложного периодонтита. При этом наиболее высокое значение медианы позитивности определялось в группе быстропрогрессирующего периодонтита, статистически незначимо снижалось в группе хронического простого и было наименьшим в группе хронического сложного периодонтита. Похожая тенденция выявлена и в отношении показателя доли пикселей с высокой и умеренной интенсивностью и индекса общей интенсивности ИГХ реакции.
Особенности экспрессии ММП-1 в стромальном компоненте десны (рис. 2, 4) соответствовали уже выявленным особенностям ИГХ окрашивания с наибольшей площадью и интенсивностью экспрессии в группе быстропрогрессирующих периодонтитов и статистически значимо более низкими показателями в группах периодонтитов с признаками хронического течения. Одновременно группы хронического простого и сложного перио-донтитов не имели статистически значимых различий по изученным параметрам экспрессии ММП-1 как в ткани десны в целом, так отдельно в стромальном компоненте.
Согласно полученным результатам, оценка экспрессии ММП-1 отдельно в стромальном компоненте, а также комплексная оценка экспрессии ММП-1 в эпителиальном и стромальном компоненте десны имеет значение для дифференциальной диагностики хронических форм периодонтитов (простого и сложного) от быстропрогрессирующего периодонтита. При этом среди изученных морфометрических показателей наиболее информативным является доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью, которая в группе патологии периодонта с быстропрогрессирующим разрушением периодонтальных тканей и альвеолярного отростка челюсти, вдвое превышает таковые в группах периодонтитов с хроническим течением.
Заключение
Проведенный анализ характера экспрессии ММП-1 в биопсийном материале десен пациентов с патологией периодонта показал, что все изученные показатели могут быть использованы для дифференциальной диагностики различных форм периодонтитов. Однако наиболее информативным с точки зрения определения прогноза течения периодонтитов является доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью, которая в группе быстропрогрессирующего периодонтита практически вдвое превышает таковые в группах хронического простого и сложного периодонтитов и ассоциирована с выраженностью воспалительной инфильтрации и альтеративными изменениями эпителия.
Исследование качественных и количественных характеристик экспрессии ММП и их ингибиторов в ткани десны, десневой и ротовой жидкости представляет собой перспективное направление фундаментальных исследований, которое позволит разработать новые подходы к диагностике, прогнозированию течения и лечению заболеваний периодонта.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Ярмолинская, М.И. Матриксные металлопротеиназы и ингибиторы: классификация, механизм действия / М.И. Ярмолинская, А.С. Молотков, В.М. Денисова // Журнал акушерства и женских болезней. – 2012. – Т.61, №1. – С.113–125. / Yarmolinskaya M.I., Molotkov A.S., Denisova V.M. Matriksnyye metalloproteinazy i ingibitory: klassifikatsiya, mekhanizm deystviya [Matrix metalloproteinases and inhibitors: classification, mechanism of action]. Zhurnal akusherstva i zhenskikh bolezney, 2012, vol.61, no.1, pp.113–125. (in Russian)
2. Birkedal-Hansen H. Role of matrix metalloproteinases in human periodontal diseases. J Periodontol, 1993, vol.64, no.5, pp.474–484.
3. Cao Z., Li C., Jin L., Corbet E.F. Association of matrix metalloproteinase-1 promoter polymorphism with generalized aggressive periodontitis in a Chinese population. J Periodontal Res, 2005, vol.40, pp.427–431.
4. Cavalla F., Hernandez-Ríos P., Sorsa T., Biguetti C., Hernandez M. Matrix metalloproteinases as regulators of periodontal inflammation. Int J Mol Sci, 2017, vol.18, no.2, p.440.
5. Cox S.W., Eley B.M., Kiili M., Asikainen A., Tervahartiala T., Sorsa T. Collagen degradation by interleukin-1b-stimulated gingival fibroblasts is accompanied by release and activation of multiple matrix metalloproteinases and cysteine proteinases. Oral Dis, 2006, vol.12, pp.34–40.
6. Ertugrul A.S., Dursun R., Dundar N., Avunduk M.C., Hakki S.S. MMP-1, MMP-9, and TIMP-1 levels in oral lichen planus patients with gingivitis or periodontitis. Arch Oral Biol, 2013, vol.58, no.7, pp.843–852.
7. Holla L.I., Jurajda M., Fassmann A., Dvorakova N., Znojil V., Vacha J. Genetic variations in the matrix metalloproteinase1 promoter and risk of susceptibility and/or severity of chronic periodontitis in the Czech population. J Clin Periodontol, 2004, vol.31, pp.685–690.
8. Itagaki M., Kubota T., Tai H., Shimada Y., Morozumi T., Yamazaki K. Matrix metalloproteinase-1 and -3 gene promoter polymorphisms in Japanese patients with periodontitis. J Clin Periodontol, 2004, vol.31, pp.764–769.
9. McCawley L.J., Matrisian L.M. Matrix metalloproteinases: they’re not just for matrix anymore! Curr Opin Cell Biol, 2001, vol.13, pp.534–540.
10. Popat, R.P., Bhavsar N.V., Popat P.R. Gingival crevicular fluid levels of Matrix Metalloproteinase-1 (MMP-1) and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) in periodontal health and disease. Singapore dental journal, 2014, vol.35, pp.59–64.
11. Santos M.L., Campos M.I., Souza A.P., Trevilatto P.C., Line S.R. Analysis of MMP-1 and MMP-9 promoter polymorphism in early osseointegrated implant failure. Int J Maxillofac Implants, 2004, vol.19, pp.38–43.
12. Sorsa T., Tjaderhane L., Konttinen Y.T., Lauhio A., Salo T., Lee H.M., Golub L.M., Brown D.L., Mantyla P. Matrix metalloproteinases: Contribution to pathogenesis, diagnosis and treatment of periodontal in?ammation. AnnMed, 2006, vol.38, pp.306–321.
13. Souza A.P., Trevilatto P.C., Scarel-Caminaga R.M., Brito R.B., Line S.R. MMP-1 promoter polymorphism: association with chronic periodontitis severity in a Brazilian population. J Clin Periodontol, 2003, vol.30, pp.154–158.
14. Uria J.A., Jimenez M.G., Balbin M., Freije J.M., Lopez-Otin C. Differential effects of transforming growth factor-beta on the expression of collagenase-1 and collagenase-3 in human fibroblasts. J Biol Chem, 1998, vol.273, pp.9769–9777.
15. Visse R., Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. CircRes, 2003, vol.92, pp.827–839.
Конфликт интересов
Согласно заявлению авторов, конфликт интересов отсутствует.
Современная стоматология. – 2020. – №2. – С.83-88.
Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.