Внимание! Статья адресована врачам-специалистам

Sayfullayeva S.A.

Tashkent Medical Academy, Uzbekistan

Functional metabolic interrelation of nitrergic

and monooxygenase systems in hepatocyte microsomes

in experimental liver ischemia

Резюме. Выявленные закономерности изменений в микросомах в динамике формирования ишемии/гипоксии и в долях печени с сохранившимся кровообращением активность ферментов монооксигеназной системы (МОС) в зависимости от уровня факторов, составляющих нитрооксигеназную систему, свидетельствуют о важности этой системы в регуляции активности ферментов МОС, детоксикации ксенобиотиков в патогенезе повреждения гепатоцитов при гипоксии/ишемии печени.

Ключевые слова: ишемии печени, оксид азота, нитрооксигеназная и монооксигеназная системы.

Медицинские новости. – 2019. – №5. – С. 82–86.

Summary. The revealed patterns of changes in microsomes in the dynamics of the formation of ischemia / hypoxia and in the liver lobes with preserved blood circulation, the activity of enzymes of the monooxygenase system (MOS) depending on the level of factors constituting the nitro-oxygenase system, indicate the importance of this system in regulating the activity of enzymes MOS, detoxification of xenobiotics in pathogenesis hepatocyte damage during hypoxia / liver ischemia.

Keywords: liver ischemia, nitrous oxide, nitro-oxygenase and monooxygenase systems.

Meditsinskie novosti. – 2019. – N5. – P. 82–86.

В настоящее время особый интерес представляет оксид азота (NO) как один из факторов регуляции функциональных систем в печени. Биологические эффекты NO в тканях печени реализуются через механизмы функционирования изоферментов NO-синтаз (NOS)   двух конститутивных (нейрональной и эндотелиальной) и одной индуцибельной.

Важным субстратом синтеза NO при участии NOS является аминокислота L-аргинин [5, 6]. Изоформы NOS могут локализоваться на мембранных структурах, а также находиться в цитозоле гепатоцитов и при повышенной их проницаемости попадать в системный кровоток. Для продукции NO на мембранных структурах, в частности, на гладком эндоплазматическом ретикулуме (микросомах), используются такие субстраты, как аргинин, кислород, кофакторы никотинамидаденин-динуклеотид фосфат окисленный (НАДФН), тетрагидробиоптерин (ВН₄), флавинадениндинуклеотид (FAD), флавинаденинмононуклеотид (FMN), а также кальцийкальмодулин [10].

Нитрооксигеназная и монооксигеназная системы (МОС) в окислительно-востановительных реакциях используют НАДФН-генерирующие ферменты и являются НАДФН-зависимыми системами. МОС участвует, главным образом, в поддержании физико-химического гомеостаза, детоксикации чужеродных соединений, в том числе и NO [1, 11]. Нитрооксигеназная система осуществляет синтез и поддерживает гомеостаз NO. В физиологических условиях на уровне микросом функциональная активность МОС и нитрооксигеназной систем уравновешена. Однако при патологии ишемии/гипоксии эти две системы для своего функционирования могут конкурировать за использование субстратов окисления и кофакторов, тем самым влиять на специфику развития структурных перестроек в ткани печени, приспособительных механизмов по детоксикации ксенобиотиков в этом органе. Вместе с тем, в литературе практически отсутствуют сведения о функционально-метаболической взаимосвязи этих систем на уровне микросомального окисления, в том числе при ишемии печени.

Цель исследования – оценить активность нитрооксигеназной и монооксигеназной систем, их функционально-метаболические взаимосвязи в микросомах, выделенных из гепатоцитов крыс в динамике острой ишемии печени.

Материалы и методы

Исследования проведены на 72 крысах-самцах смешанной популяции массой 180–220 г. Ишемию/гипоксию вызывали путем лигирования шелковой нитью сосудистой ножки левой боковой и средней доли печени. После 30, 60, 120, 180 мин ишемии/гипоксии печени животных забивали методом мгновенной декапитации. В качестве контроля использовали микросомы долей печени с сохраненным кровообращением (контроль 1) и печени интактных животных (контроль 2). Каждая группа состояла из 8 особей. Печень перфузировали через нижнюю полую вену охлажденным (0±4 °С) 50 мМ Трис НСl буфером, рН 7,4, содержащим 0,05 М КCl и 0,25 М сахарозы. После отмывки печени от крови ее измельчали и гомогенизировали в таком же растворе (1:3). Из постмитохондриальной фракции, которую получали путем центрифугирования на VAC-602 (Германия) после 20 мин открутки при 12 тыс. g, осаждали микросомы при 105 тыс. g в течение 60 мин. Все процедуры выполняли в холодильной камере КХС-12 (Россия) при 0±4 °С. В микросомах, ресуспензированных в 100 мМ Трис НСl буфера, рН 7,4, определяли нитрооксигеназную активность по содержанию стабильных метаболитов нитритов и нитратов NO – NO_{2^{- и NO3-}} по методу П.П. Голикова и соавт. (2000), активность эндотелиальной NOS(eNOS) по В.В. Сумбаевой, И.М. Ясинской (2000), индуцибельная NOS (iNOS) и концентрация пероксинитрита (ONO2-) по М.Ю. Раваевой, Е.Н. Чуян (2011), монооксигеназную активность – по содержанию цитохромов Р-450, Р-420 и b5 классическим методом Т. Omura, R. Sato (1964), активность НАДФН С-редуктазы (НАДФН-цит.с-ред.) по C.H. Williams, H. Kamin (1961), бенз(а)пиренгидроксилазы (Б(а)ПГ) по C.H. Yang, L.P. Kicha (1978), анилингидроксилазы (АГ) по А.И. Арчакову и соавт. (1975), N-деметилазы амидопирина (N-АП) по A. Bast, J. Nordhosck (1981), глюкозо-6-фосфатазы (Г-6-Фазы) по N.S. Gnosh, N.C. Kar (1983).

Содержание и активность оксидоредуктаз нитрооксигеназной и монооксигеназной систем регистрировали на компьютеризированном двухлучевом спектрофотометре UV-2100 (Китай). Содержание и активность оксидоредуктаз рассчитывали в микросомах на миллиграмм белка в 1 мл (мг/мл), который определяли по методу О.Н. Lowry и соавт. (1951).

Полученные результаты подвергнуты статистической обработке с помощью пакета прикладных программ Excel, STATISTICА 6,0. Данные считались достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Изучение состояния нитрооксигеназной системы показало, что оперативное вмешательство (нембуталовый наркоз 35 мг/кг, лапаротомия, наложение лигатуры на сосудистую ножку левой боковой и средней долей печени) приводило к тому, что в микросомах, выделенных из долей печени с сохраненным кровообращением (контроль 1), в отличие от микросом, выделенных из долей печени интактных животных (контроль 2), содержание NO через 30, 60, 120, 180 мин возрастало в 1,27; 1,29; 1,30 (р<0,01) и 1,17 (р<0,05) раза, а активность eNOS соответственно в 1,18; 1,09; 1,2 и 1,15 раза (р<0,05). При этом активность iNOS и уровень концентрации ONO_2^- сохранялись в пределах значений интактных животных (табл. 1).

Таблица 1. Показатели активности NO-системы в микросомах, выделенных в долях печени с сохраненным кровообращением (числитель – контроль 1), по сравнению с таковыми, взятыми из ишемизированной доли печени (знаменатель), и интактной группой (контроль 2), М±m

 Примечание: Здесь и в табл. 2 * – р<0,05 по сравнению с контролем 2; ? – р<0,05 по сравнению с контролем 1.

Содержание цитохрома Р-450 у животных с сохранением в долях печени кровообращения было выше, чем у интактных животных после 30, 120, 180 мин ишемии печени соответственно в 1,37 (р<0,001); 1,30 (р<0,001) и 1,19 (р<0,05) раза, а после 60 мин оставалось в пределах значений, полученных у интактных животных (табл. 2).

Таблица 2. Активность ферментов МОС в микросомах гепатоцитов, выделенных из сохраненной доли печени крыс при острой ишемии печени (контроль 1 – знаменатель) и ишемизированной доли (опытная группа – числитель), в зависимости  от сроков ишемии/реперфузии печени, по сравнению с показателями в интактной (контроль 2), М±m

Вместе с тем, содержание цитохромов Р-420 и b5после 30, 60, 120, 180 мин ишемии печени в долях с сохраненным кровообращением оставалось на уровне значений интактных животных. Через 30 мин в микросомах, выделенных из гепатоцитов с сохраненным в долях печени кровообращением, отмечалось статистически значимое повышение активности НАДФН-с-ред. в 1,21 (р<0,05) раза, Б(а)ПГ – в 1,17 (р<0,05) раза, АГ, N-АП и Г-6-Фазы в 1,18; 1,15 и 1,16 раза (р<0,05). После 60 мин все ферменты МОС были в пределах значений у животных интактной группы, а через 120 мин активность НАДФН-с-ред. вновь увеличилась в 1,29 (р<0,01) раза, Б(а)ПГ, АГ, N-АП и Г-6-Фазы – в 1,24 (р<0,05); 1,35; 1,23 и 1,27 раза (р<0,01), сохраняясь практически на этом уровне вплоть до 180 мин ишемии печени. Содержание микросомального белка у животных опытной группы оставалось в пределах значений интактных крыс.

Повышение в микросомах активности eNOS и, как следствие, увеличение физиологического уровня NO и ряда основных ферментов МОС с сохраненным кровообращением доли печени, возможно, было обусловлено компенсаторно-приспособительными реакциями неповрежденных патологическим процессом микросом печени в ответ на стресс, связанный с активацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системами, экспрессией индукторов eNOS, таких как ацетилхолин, брадикинин, серотонин, глутамат, субстанции Р, тромбин, АДФ [3, 9], а также индукторов ферментов гидро-ксилирования ксенобиотиков (кортизол, кортикостероиды и др.) [2, 11].

Необходимо подчеркнуть, что повышение активности eNOS и базального уровня NO совпадает с интенсификацией активности ферментов МОС, особенно через 30 и 120 мин, в микросомах долей печени с сохраненным кровообращением, что является ответной реакцией на стресс, вызванной развитием ишемии/реперфузии, наложением лигатуры на сосудистую ножку левой боковой и средней долей печени. При этом выявлена сильная прямая корреляционная зависимость между показателем eNOS и содержанием цитохрома Р-450 через 30 мин – r=0,83 (р<0,01) и 120 мин – r=0,80 (р<0,01), умеренная зависимость с НАДФН-с-ред. – r=0,77 и 0,73 (р<0,05), Б(а)ПГ – r=0,73 и 0,68 (р<0,05), АГ – r=0,75 и 0,77 (р<0,05), N-АП – r=0,72 и 0,70 (р<0,05), Г-6-Фазы – r=0,69 и 0,67 (р<0,05).

Следовательно, одним из факторов компенсаторного повышения функцио-нально-метаболической активности ферментов МОС в долях печени с сохраненным кровообращением является интенсификация eNOS как следствие повышения базального уровня в микросомах NO. Уровень NO в микросомах возрастал адекватно активности фермента eNOS.

Важно подчеркнуть, что в микросомах гепатоцитов, выделенных из печени с сохраненным кровообращением, спектральные характеристики ферментов iNOS и концентрация ONO_2^- были в пределах тех значений, которые отмечались у интактных животных.

Одной из важных задач нашего исследования было изучение активности нитрооксигеназных и МОС ферментов в ишемизированных долях печени. Установлено, что через 30, 60, 120 и 180 мин в микросомах, выделенных из этих долей печени, отмечалось динамичное увеличение содержания NO на фоне угнетения активности фермента eNOS и экспрессии iNOS, уровня концентрации ONO_2^-. Максимальные нарушения в NO-системе микросом обнаруживались через 180 мин ишемии печени. При этом уровень NO в микросомах ишемизированной печени был статистически значимо выше контроля 1 и значений у животных интактной группы (контроль 2) соответственно в 1,65 и 1,93 раза (р<0,001), активность eNOS снижалась в 2,08 и 1,81 раза (р<0,001), экспрессия iNOS возрастала в 2,1 и 1,9 раза (р>0,001), а концентрация ONO2- – в 2,44 и 2,5 раза (р<0,001).

При анализе функционально-метаболической активности ферментов МОС установлено, что в выделенных из ишемизированных долей печени микросомах через 30 мин опыта наиболее подверженными нарушениям оказались ферменты НАДФН-цит. с-ред. – среднее звено НАДФН – цито-хром Р-450 электронтранспортной системы монооксигеназ и Г-6-Фаза – маркер функциональной активности микросом, участвующий в гомеостазе глюкозы и катализирующий терминальные реакции гликогенолиза и глюконеогенеза, выполняя в этих процессах и метаболических реакциях ферментов МОС адаптивную роль. С увеличением срока ишемии/гипоксии до 60, 120 и 180 мин отмечается прогрессирующее снижение активности всех изучаемых ферментов МОС, кроме цитохрома Р-420, уровень которого с увеличением времени гипоксии существенно возрастал.

Чтобы подтвердить важность НАДФН-генерирующей системы в механизмах регуляции активности нитрооксигеназной системы и МОС, нами проведены опыты in vitro. Установлено, что добавление НАДФН 5 мкмоль/мл в микросомы выделенных из ишемизированной доли печени не влияло на изменение высоты пика цитохрома Р-450 и Р-420. Однако в 1,35 раза (р<0,01) увеличивал активность НАДФН-цит.с-редуктазную активность, в 1,6 раза (р<0,001) – скорость реакции iNOS, концентрацию NO – в 2,3 раза (р<0,001) и ONO_2^- – в 1,8 раза (р<0,001), а активность eNOS угнеталась в 1,4 раза (р<0,001). Добавление этой же дозы НАДФН в микросомы активированной доли (контроль 1) инициировало активность eNOS в 1,22 раза (р<0,01), возрастание пика Р-450 – в 1,3 раза (р<0,01), активность НАДФН-цит.с ред. возрастала – в 1,4 раза (р<0,001), Г-6-Фаза – в 1,27 раза (р<0,01), полное исчезновение пика Р-420, увеличение NO – в 1,15 раза (р<0,05), угнетение скорости реакции фермента iNOS – в 1,3 раза (р<0,01) и уровень концентрации ONO2- – в 1,25 раза (р<0,01). Аналогичная тенденция сохранялась и в опытах с микросомами, выделенными из печени интактных животных. Добавление в генерирующую систему НАДФН увеличивался пик цитохрома Р-450 в 1,22 раза (р<0,05), активность НАДФН-цит. с ред. – в 1,35 раза (р<0,001). Одновременно возрастала активность eNOS в 1,26 раза (р<0,01) на фоне угнетения iNOS – в 1,22 раза (р<0,05) и уменьшения уровня концентрации ONO2- – в 1,31 раза (р<0,001).

Выявленное различие в изменении активности нитрооксиредуктаз и МОС в зависимости от скорости реакции НАДФН-цит.с редуктазы в наших исследованиях подтверждает важность челночного действия НАДФН-генерирующей системы в механизмах их регуляции при патологических состояниях, в частности при острой ишемии печени.

Выявленная стехиометрия между снижением содержания в микросомах цитохрома Р-450 и увеличением количества цитохрома Р-420 по мере повышения срока ишемии печени указывает на отсутствие значительных повреждений белковой структуры гемопротеида [10]. По данным некоторых авторов, повреждение белковой структуры гемопротеида в случае увеличения длительности ишемии должно было бы приводить к снижению абсорбционных пиков как при 450 нм, так и при 420 нм. Все это свидетельствует об обратимости процесса стехиометрии на уровне цитохромов Р-450 и Р-420 и потенциальную возможность восстановление функциональной активности цитохрома Р-450 и контролируемой им микросомальных ферментов.

Важным показателем отсутствия повреждения белковой структуры микросом при ишемии/гипоксии служит сохранение на уровне значений интактных животных содержания микросомального белка во все сроки ишемии. Можно полагать, что одной из причин снижения содержания микросомальных ферментов МОС, по-видимому, является гиперэкспрессия NO и ONO_2^-, обусловленная инициацией iNOS. Эту гипотезу подтверждает четкая взаимосвязь (r=0,86-0,91) увеличения NO, iNOS и ONO2- с цитохромом Р-420 и обратная их корреляция (r=-0,9-0,98) с цитохромом Р-450, b5, активностью НАДФН-с-ред., Б(а)ПГ, АГ, N-АП и Г-6-Фазы и прямая связь угнетения активности eNOS (r=0,87-0,96) с этими ферментами, а также обратная связь с цитохромом Р-420.

Необходимо подчеркнуть, что в ишемизированных долях печени в микросомах уровень NO увеличивается не за счет eNOS, а за счет экспрессии iNOS, так как eNOS угнетается, а iNOS повышается. С увеличением времени ишемии/гипоксии вследствие экспрессии iNOS возрастает NO, одновременно повышается и интенсивность процессов свободно-радикального окисления с образованием супероксидного кислорода (О₂^-) [4, 7]. Это создает благоприятные условия для реакции NO с О₂^- и образования высокоцитотоксического соединения ONO_2^- [3, 9]. Его уровень с усугублением ишемии/гипоксии прогрессивно повышается. Одновременно снижается активность всех изучаемых ферментов микросом МОС в ишемизированных долях печени.

Выявленная корреляционная связь между высоким показателем NO и ONO_2^- угнетением основных ферментов МОС подтверждает мнение об их патогенетической взаимозависимости в процессах снижения функцио-нально-метаболической активности микросом в ишемизированной печени. Вместе с тем, возрастание стехиометрии между цитохромом Р-450 и Р-420 по мере увеличения срока ишемии/гипоксии свидетельствует об обратимости процесса и возможности коррекции выявленных нарушений нитрооксигеназной и монооксигеназной систем при гипоксии/ишемии печени.

Таким образом, проведенные исследования выявили, что на уровне микросом в условиях острой ишемии печени наблюдается тесная функциональная взаимосвязь между NO-системой и МОС. Это проявляется в особенностях использовании НАДФН-цит.с-редуктазы. Снижение уровня активности в НАДФН-цит.с-ред. в микросомах при ишемии печени приводит к угнетению всех ферментов МОС и дисбалансу активности ферментов NOS – гиперэкспрессии NO, ONO_{2^{-, скорости реакции iNOS и угнетению eNOS.}}

Выводы:

1. В микросомах, выделенных из ишемизированной ткани печени, с увеличением длительности гипоксии прогрессивно возрастает степень дисфункциональных изменений в нитрооксигеназной системе – угнетается активность eNOS, происходит гиперэкспрессия NO, iNOS и ONO_{2^{-, снижается активность ферментов МОС – цитохромов Р-}}450 и b5, активность НАДФН-с-ред., Б(а)ПГ, АГ, N-АП и Г-6-Фазы на фоне стимулирования образования стехиометрической неактивной формы цитохрома Р-420 из цитохрома Р-450.

2. Выявлена сильная прямая корреляционная зависимость (r>0,8) между показателем снижения активности eNOS и депрессией скорости реакции основных параметров ферментов МОС – цитохрома Р-450, b5, НАДФН-с-ред., Б(а)ПГ, АГ, N-АП и Г-6-Фазы и их сильная обратная корреляция с экспрессией NO, iNOS и ONO_2^-.

3. В выделенных из ткани печени с сохраненным кровообращением микросомах отмечена прямая корреляция между увеличением активности eNOS, концентрации базального уровня NO и повышением функционально-метаболической активности основных ферментов МОС.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Арчаков А.И., Лисица А.В., Петушкова Н.А., Карузина И.И. // Клин. мед. – 2008. – №2. – С.4–8.

2. Венгеровский А.И., Батурина Н.О., Саратиков А.С. // Эксп. и клин. фарм. – 1999. – Т.62, №1. – С.75–80.

3. Звенигородская Л.А., Нилов Т.В. // Рус. мед. журн. – 2008. – Т.10, №2. – С.47–50.

4. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. // Бюл. СО РАМН. – 2005. – №4. – С.7–12.

5. Манухина Е.Б., Дауни Х.Ф., Маллет Р.Т., Меньшев И.Ю. // Вестн. РАМН. – 2007. – №2. – С.25–33.

6. Марков Х.М. // Кардиология. – 2005. – №12. – С.62–72.

7. Покровский В.И., Виноградов Н.А. // Тер. арх. – 2005. – №1. – С.82–87.

8. Стародубцева М.Н. Пероксинитрит в физиологии и патологии клеток крови. – М., 2011. – 200 с.

9. Шумянцева В.В., Булко Т.В., Арчаков А.И. // Биомед. химия. – 2004. – Т.50. – С.243–259.

10. Berka V., Wu G., Yen H.C., Palmer G., Tsai A.L. // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol.279. – P.32243–32251.

11. Blaise G.A., Gauvin D., Gangal M., Authier S. // Toxicology. – 2005. – Vol.208. – P.177–192.

Медицинские новости. – 2019. – №5. – С. 82-86.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.