Внимание! Статья адресована врачам-специалистам

Ahmadov G.A.

Azerbaijan Medical University, Baku

CTLA4 gene association of type 1 diabetes in an Azerbaijanian population

Резюме. Изучен полиморфизм гена CTLA4 у 160 детей с инсулинзависимым сахарным диабетом и у 271 здорового добровольца. Среди лиц с сахарным диабетом 50,6% составили мальчики, 49,4% – девочки. В ряде исследований многих зарубежных авторов было выявлено, что у некоторых национальностей имеется связь полиморфизма гена CTLA4 с сахарным диабетом. В ходе проведенного исследования было установлено отсутствие ассоциации между полиморфизмом гена CTLA4 и сахарным диабетом. Отрицательный результат, полученный в азербайджанской популяции, не исключает положительного результата для других вариантов CTLA4.

Ключевые слова: сахарный диабет, T-клетки, ген CTLA4.

Медицинские новости. – 2017. – №5. – С. 76–78.

Summary.We studied the polymorphism of CTLA4 gene in 160 children with insulin-dependent diabetes and 271 healthy controls. Among those with diabetes of 50.6% boys, 49.4% girls. A number of studies of many foreign authors, it was revealed that some nationalities there is a link of CTLA4 gene polymorphism with diabetes. In the course of the study found no association between CTLA4 gene polymorphism and diabetes mellitus. A negative result is obtained in the Azerbaijani population does not preclude a positive result for other variants of CTLA4.

Keywords: CTLA4 gene, T-cell, diabetes mellitus.

Meditsinskie novosti. – 2017. – N5. – P. 76–78.

Ген CTLA4 (ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами антиген 4, поверхностный антиген цитотоксических T-лимфоцитов, rs231775) является антигеном, оказывающим влияние на активность T-лимфоцитов. Ген CTLA4 расположен на длинном плече 33-го региона 2-й хромосомы, состоит из 4 экзонов и 1 интрона, включает 223 аминокислоты. Для этого гена известно 30 полиморфизмов, то есть изменений последовательности аминокислот. Одним из этих полиморфизмов является полиморфизм +49 A/G. Полиморфизм гена CTLA4 заключается в замене аденина в 49-й позиции 1 экзона на гуанин, в результате чего в 17-й позиции треонин заменяется на аланин. В результате полиморфизма аллель G снижает Т-клеточную активность и усиливает аутоиммунные процессы. Синтезированный со стороны гена CTLA4 рецептор соединяется с CD80 и CD86 на антиген презентирующих клетках и тем самым снижает Т-клеточную активность CD28 [1].

При исследовании разных популяций на предмет связи между сахарным диабетом и геном CTLA4 были получены неоднозначные результаты. В некоторых исследованиях связь была обнаружена, в других подобной закономерности выявлено не было. Например, в русской, украинской, японской, польской, французской и румынской популяциях такая связь имеет место, в чешской популяции и некоторых этнических группах России ее обнаружить не удалось [2].

В ходе экспериментов, проведенных на мышах, было установлено, что отсутствие в организме Т-регуляторных клеток способствует развитию различных аутоиммунных заболеваний, при том, что повторное введение их в организм предотвращает возникновение аутоиммунных процессов. Для подавления иммунной системы указанные клетки синтезируют TGF -b, IL-10, IFN-g, IL-35, в то же время имеют на поверхности рецепторы CTLA4. Известны несколько видов супрессии: прямая и опосредованная. Прямая происходит при контакте с клетками, а опосредованная – в результате дистанционного воздействия цитокинов. Мишенью для T-регуляторных клеток являются T-эффекторы и дендритные клетки. Дендритные клетки ответственны за презентирование антигена и активацию Т-клеток. В результате дистанционного воздействия Т-регуляторы синтезируют TGF -b, который, в свою очередь, соединяется с соответствующими рецепторами на поверхности T-эффекторов, что приводит к их инактивации и торможению иммунного ответа. T-регуляторные клетки с помощью CD25-рецепторов соединяются с IL-2 и после присоединения Т-эффекторов к клеткам комплекса НLA инактивируют их. IL-2 ответственен за дифференциацию T-лимфоцитов. T-регуляторные клетки посредством рецептора CTLA4 присоединяются к находящемуся на поверхности дендритных клеток рецептору CD86 и таким образом инактивирует их. При непосредственном воздействии они присоединяются к Т-эффекторам, что приводит к образованию перфоринов, благодаря действию которых гранзимы В проникают внутрь клеток и способствуют их апоптозу.

Т-регуляторные клетки (Тreg) воздействуют на T-эффекторные клетки (T-хелперы и T-киллеры). Тreg экспрессируют фактор транскрипции FoxP3. Фактор транскрипции играет роль «ключа» в процессах копирования любого гена. Фактор FoxP3 регулирует транскрипцию гена CTLA4. Этот ген ответственен за дифференциацию T-клеток и синтез цитокинов. Эти клетки называют также клетки FoxP3+Treg. Одной из важных особенностей этих клеток является наличие на их поверхности рецептора CD25. Этот рецептор соединяется с IL-2 и тем самым тормозит активацию Т-эффекторных клеток. Существует несколько типов регуляторных клеток: природные T-регуляторные клетки (Treg1), индуцибельные T-регуляторные клетки (iTreg) и др.

Под действием цитокинов и окружающей среды из нулевых (нативных) CD4+ T-хелперов (Th0) образуются различные типы Т-хелперов. В результате совместного воздействия IL-12 TGF -? образуются Th1-клетки, под влиянием IL-4 – Th2-клетки, под влиянием TGF -b T-регуляторные клетки, под влиянием IL-6 и TGF -b – Th17-клетки. Зрелые T-хелперы синтезируют определенные факторы, стимулирующие цитокины. У каждого вида Тh-клеток существует собственный фактор транскрипции, за счет которого происходит активация и дифференциация этих клеток. Для Th1 фактором транскрипции является T-bet, для Th2 – GATA-3, c-Maf, для Th17 – ROR?t, для Treg – FoxP3 [3].

Th1-хелперы синтезируют ?-интерферон, активируют Т-киллеры и клеточный иммунитет. Th2-хелперы активируют B-лимфоциты и синтезируют IL-4, -5, -13. Другое название Th3-хелперов – T-регуляторные клетки. На их поверхности расположена молекула CD25, они экспрессирует фактор транскрипции FoxP3, синтезируют IL-10, TGF -b и вызывают иммуносупрессию.

Впервые о T-регуляторных клетках и их способности тормозить активность иммунных клеток было упомянуто в 1975 году [4].

В результате исследований было установлено, что у лиц, склонных к развитию сахарного диабета, согласно комплексу НLA и вырабатывающих ряд антител к поджелудочной железе, происходит ускорение апоптоза за счет снижения активности T-супрессоров CD4+ и CD25+. Ускорение апоптоза, в свою очередь, повышает скорость повреждения b-клеток. Известно, что T-супрессоры оказывают свое влияние путем секреции цитокинов TGF -b, IL-10, ?-интерферон, IL-35. Между генотипом НLA DQB1 и T-супрессорами CD4+ и CD25+ имеется положительная корреляционная связь [5].

Как известно, у лиц с сахарным диабетом происходит деструкция b-клеток поджелудочной железы в результате повышенной реактивности Т-клеток [6].

Клетки CD4+ и CD25+ Treg активируются после стимуляции синтеза антител против поджелудочной железы. Эти клетки тормозят реактивность Т-клеток и тем самым предотвращают повреждение поджелудочной железы [7].

Т-клетки играют важную роль в патогенезе сахарного диабета. В развитии патологического процесса основополагающее значение имеет баланс между регуляторными и аутореактивными Т-клетками. Установлено, что уровень CD4+, CD25+, CD127-/low Treg в крови лиц с сахарным диабетом ниже, чем у здоровых (35,16±4,93% и 60,45±5,26%, p=0,0015 соответственно) [8]. За счет аутореактивности T-клеток память сохраняется долгое время и повышается после стимуляции антител [9].

Инсулинзависимый сахарный диабет является хроническим аутоиммунным заболеванием. В результате аутоиммунных процессов происходит деструкция b-клеток поджелудочной железы. Активированные антиген презентирующими клетками (APC) цитотоксические клетки CD4+ и CD8+ усиливают деструктивные процессы. С другой стороны, Treg принимают активное участие в толерантности иммунной системы и поддержании гомеостаза и тормозят функцию T-эффекторных клеток. После активации T-эффекторные клетки временно повышается синтез IL-2, это увеличивает и число T-эффекторных Treg-клеток. Впоследствии клетки Treg тормозят образование T-эффекторных клеток. Взаимоотношения между этими 2 группами клеток влияют на остаточную функцию b-клеток. Доминирование Treg-клеток завершается так называемым «медовым месяцем», то есть развитием ремиссии. Длительное сохранение синтеза IL-2 несколько замедляет процесс прогрессирования диабета [10].

Таблица. Распределение аллелей CTLA4 +49 A/G у обследованных

Известно, что клетки Treg (CD4(+), CD25(+), FoxP3(+)) защищают клетки поджелудочной железы от деструкции. Учитывая это, лицам с сахарным диабетом вводили специальную инфузионную форму Treg-клеток внутривенно в виде 1 или 2 инъекций. Побочных эффектов отмечено не было. В результате исследования было выявлено, что у больных после данной инфузии повысился уровень С-пептида и снизилась потребность в инсулине [11].

В регуляции Treg и T-эффекторных клеток в крови IL-2 играет важную роль. Снижение уровня этого цитокина ускоряет деструктивные изменения. Был изготовлен и применен у пациентов препарат, содержащий IL-2. У этих больных снизился титр антител и стабилизировалось течение заболевания [12].

Для точной оценки состояния клеток Treg более важное значение имеет определение характера изменений, происходящих в гене [13].

По всей вероятности, повышение уровня IL-12 и -18 приводит к уменьшению количества клеток Treg, что, в свою очередь, усиливает деструктивные изменения [14].

В одном из экспериментальных исследований после внутривенного введения клеток Treg в виде инфузии было отмечено снижение в крови уровня CD8(+) и CD4(+) T-клеток и g-интерферона. Тем самым подобное введение предотвращало развитие иммунного воспаления в поджелудочной железе [15].

Клетки Treg синтезируют цитокины CCL3 и CCL4, оказывая посредством этих цитокинов влияние на клетки CD4+ и CD8+, замедляют аутоиммунные деструктивные процессы, вызванные воздействием иммунной системы [16].

Целью исследования явилось изучение полиморфизма гена CTLA4 у детей азербайджанской популяции.

Материалы и методы

Полиморфизм гена CTLA4 был исследован у 160 детей с инсулинзависимым сахарным диабетом и у 271 здорового добровольца. Из 160 лиц с сахарным диабетом 50,6% (n=81) составили мальчики, 49,4% (n=79) – девочки. Все дети с сахарным диабетом были в возрасте до 18 лет. Диагноз сахарного диабета был верифицирован согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения. Средний возраст больных составил 9,1 года. Дети были разделены на следующие возрастные группы: 0–4 года (n=18), 5–9 лет (n=63), 10–14 лет (n=72), 15–18 лет (n=7). Обследование проводилось на базе 6-й детской клинической больницы Баку. Для всех пациентов была заполнена специальная карта опроса. В исследование были включены только дети азербайджанской национальности.

В качестве группы сравнения был привлечен 271 учащийся Медицинского колледжа №1: 29,1% (n=79) составили мальчики, 70,9% (n=192) – девочки. В контрольную группу здоровых детей не были включены ребята, имеющие эндокринные заболевания. Помимо этого, обследуемые как в основной группе, так и в контрольной не проживали на одной территории. Перед проведением необходимых исследований было получено письменное согласие как обследуемых, так и их родителей, а также соответствующее разрешение со стороны этического комитета. Взятые для анализа пробы крови хранились при температуре -200°C, затем обрабатывались при помощи реактива QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Germany). Собранные образцы крови были отправлены для дальнейшего исследования в медико-генетическую лабораторию университетской больницы Motol при универститете Charles, расположенном в Праге (Чехия). Данная лаборатория обладает европейским сертификатом для проведения молекулярно-генетических исследований.

Определение экзона-1, расположенного в 49-й позиции гена CTLA4, было проведено с помощью метода полимеразной цепной реакции.

Статистическая обработка данных проводилась путем определения x² с помощью теста Yates и его коррекции, а также с помощью точного теста Фишера. Для данных показателей были вычислены отношение шансов, доверительный интервал и доверительная вероятность p. Различия считались достоверными при р≤0,05.

В ряде исследований было выявлено, что у некоторых национальностей имеется связь полиморфизма гена CTLA4 с сахарным диабетом. Как правило, этот полиморфизм имеет место у территориально близких национальностей. К примеру, подобный полиморфизм был обнаружен у представителей русской и иранской национальностей. Отрицательный результат, полученный в азербайджанской популяции, не исключает положительного результата для других вариантов CTLA4.

Таким образом, в ходе проведенного исследования было установлено отсутствие ассоциации между полиморфизмом CTLA4 +49 A/G и сахарным диабетом.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Kouki T., Sawai Y., Gardine C.A., et al. // J. Immun. – 2000. – Vol.165. – P.6606–6611.

2. Kavvoura F.K., Ioannidis J.P. // Am. J. Epidemiol. – 2005.

3. Afzali B., Lombardi G., Lechler R.I., Lord G.M. // Clin. Exp. Immunol. – 2007. – Vol.148, N1. – P.32–46.

4. Kilshaw P.J., Brent L., Pinto M. – Nature. – 1975. – Vol.255. – P.489–491.

5. Glisic S., Klinker M., Waukau J., et al. // Genes Immun. – 2009. – Vol.10, N4. – P.334–340.

6. Pinkse G.G., Tysma O.H., Bergen C.A., et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2005. – Vol.20, 102. – P.18425–18430.

7. Danke N.A., Koelle D.M., Yee C., Beheray S., Kwok W.W. // J. Immunol. – 2004. – Vol.15, N172. – P.5967–5972.

8. Aghili B., Amirzargar A.A., Rajab A., et al. // Iran J. Immunol. – 2015. – Vol.12, N4. – P.240–251.

9. Ehlers M.R., Rigby M.R. // Curr. Diab. Rep. – 2015. – Vol.15, N11. – P.84.

10. Jaberi-Douraki M., Pietropaolo M., Khadra A. // J. Theor. Biol. – 2015. – Vol.21, N383. – P.93–105.

11. Marek-Trzonkowska N., Mysliwiec M., Dobyszuk A., et al. // Clin. Immunol. – 2014. – Vol.153, N1. – P.23–30.

12. Rosenzwajg M., Churlaud G., Mallone R., et al. // J. Autoimmun. – 2015. – Vol.58. – P.48–58.

13. Pesenacker A.M., Wang A.Y., Singh A., et al. // Diabetes. – 2016. – Jan. 19. – pii: db150572 [Epub ahead of print].

14. Ryba-Stanislawowska M., Rybarczyk-Kapturska K., Mysliwiec M., Mysliwska J. // Inflammation. – 2014. – Vol.37, N5. – P.1513–1520.

15. Mahne A.E., Klementowicz J.E., Chou A., Nguyen V., Tang Q. // J. Immunol. – 2015. – Vol.1, N194. – P.3147–3155.

16. Patterson S.J., Pesenacker A.M., Wang A.Y., et al. // J. Clin. Invest. – 2016. – Feb. 8. – pii: 83987.

Медицинские новости. – 2017. – №5. – С. 39-45.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.