KhidirovaA.A., MuradovH.K., GaziyevA.Y.

Azerbaijan Medical University, Baku, Azerbaijan

Flow-cytometric studies at the diagnosis of melanocytic skin tumors

Резюме. Определение гистогенетического источника, диагностика и прогнозирование меланом возможны и целесообразны только на основе анализа всего комплекса признаков, максимально отражающих специфику опухолевых клеток. Если клинически и светооптически этот комплекс частично может быть определен в высокодифференцированных меланомах, то более широкие возможности проточной цитометрии делают реальным гистогенетическую идентификацию, дифференциальную диагностику и прогнозирование всех морфологических типов меланом.

Ключевые слова: меланома кожи, цитометрические исследования.

Медицинские новости. – 2015. – №12. – С. 44–46.

Summary. The resulting factual material suggests that the definition histogenetic source, diagnosis and prognosis of malignant melanoma possible desirability solely on the basis of analysis of the whole complex of features reflecting specificity of most tumor cells. If clinical and light microscopic, this complex can be partially defined in the highly differentiated melanomas more opportunities flow cytometry make real histogenetic identification, differential diagnosis and prediction of morphological types of melanomas.

Keywords: skin, melanoma, flow cytometry.

Meditsinskie novosti. – 2015. – N12. – P. 44–46. 

Меланома представляет собой наиболее злокачественную опухоль, метастазирующую лимфогенным и гематогенным путем. Вместе с тем клиническая, а в ряде случаев и гистологическая диагностика иногда бывает крайне трудной, так как симптоматика и морфологическое строение новообразования вариабельны.

По данным литературы, в большинстве случаев меланома возникает на визуально не измененной коже, в 25–50% – на почве пигментных меланом и обладает определенными особенностями клинического течения, требует корректной морфологической диагностики для выбора адекватного специфического лечения [2].

Цель исследования – проведение проточно-цитометрического исследования при диагностике меланоцитарных опухолей кожи.

Материалы и методы

В настоящее исследование включены данные по комплексному изучению меланом кожи пациентов, находившихся на лечении в городском онкологическом диспансере им. А.Т. Аббасова (Баку) и в Онкологической клинике Азербайджанского медицинского университета с 2003 по 2013 г.

Применялись следующие методы исследований: клинические, цитологические, гистологические, гистохимические, цитометрические.

На всех 222 пациентов были заведены протоколы, в которые из истории болезни вносили возраст, пол, локализацию патологического процесса, краткий анамнез, клинические и лабораторные данные, номера цитологических и гистологических исследований и биопсий, характер проведенной терапии.

Цитологические и гистологические методы исследования – рутинный цитологический анализ пунктатов, мазков-отпечатков, биопсий, окрашенных гематоксилином-эозином и тионином.

Изучение распределения содержания ДНК по плоидности и пролиферативной активности методом проточной цитометрии проведено у 137±54 пациентов.

Фиксацию клеток осуществляли двумя способами. По методу Z. Darzynkiewicz и соавт. к 5 мл клеточной суспензии добавляли по капле 9 мл холодной (4⁰С) смеси этанола-ацетона (1:1). Все время тщательно пипетировали полученную клеточную взвесь, тем самым препятствуя образованию конгломератов клеток, ибо 2 слипшиеся клетки регистрируются проточным анализатором как одна с удвоенным количеством ДНК. По методике J. Steinkamp и соавт. к 0,5–1,0 мл клеточной суспензии добавлялся по капле 96% этанола; при этом суспензия постоянно пипетировалась с помощью автоматической пипетки объемом на 1,5 мл. Концентрация спирта в суспензии постепенно увеличивалась до 70% (соотношение взвеси клеток и спирта 1:2,5). Пробирки плотно закрывались резиновыми пробками или пленкой Parafilm «M» (American Can. Corp., США) и после 40-часовой фиксации при 20°С клетки могли быть подвергнуты исследованию с флюорохромами. Фиксированная клеточная суспензия может храниться в холодильнике в течение нескольких месяцев. Перед исследованием одну каплю осадка окрашивали специфичным красителем ДНК – Etydium bromide (25 мг/мл, ТРИС-буфер, рН=7,4 SIGMA), фильтровали через 70 мкм нейлоновый фильтр через 10 минут. Исследование ДНК проводили на проточном цитофлюометре FACSCAN (Beston Dickinson, USA).

Сигналы оптических детекторов преобразовывались на экране дисплея и записывались в виде ДНК-гистограмм в зависимости от степени флюоресценции по следующему принципу: чем больше содержание ДНК в клетке, тем сильнее импульс и тем дальше отодвигается запись по оси абсцисс. По оси ординат регистрировалось число импульсов на канал: чем выше кривая в любой точке, тем больше клеток с соответствующим количеством ДНК сосредоточено.

В полученной гистограмме процент клеточных ядер с различным содержанием ДНК вычислялся по отношению к общему числу исследованных клеток. Минимальный коэффициент вариации находился в пределах 5,6, максимальный – 29,7. Содержание клеток по фазам клеточного цикла выражалось в процентах. В качестве диплоидного стандарта использовали лимфоциты здоровых доноров.

Если на ДНК-гистограмме присутствовал один пик, соответствующий диплоидному содержанию ДНК в ядрах, опухоль считалась диплоидной. Если ДНК-гистограмма содержала наряду с диплоидным или без него один пик отличающихся от диплоидных по содержанию ДНК-ядер, то такой материал считали анеуплоидным. Наличие двух или более разделенных пиков анеуплоидных ядер позволяло говорить о многоклоновой популяции.

Для характеристики степени анеуплои-дии применяли индекс ДНК (и-ДНК), который вычисляли как отношение интенсивности флюоресценции пика анеуплоидных клеток к пику диплоидных клеток. Индекс высчитывали как соотношение истинного канала, соответствующего исследуемой популяции клеток, к стандартному каналу. Индекс ДНК диплоидных клеток (2с) принимали за один, и-ДНК тетраплоидных клеток был равен двум, анеуплоидных – более 1,1.

Все цифровые данные подвергнуты статистической обработке непараметрическими методами по Вилкоксону и Манну – Уитни. Все вычисления проводились с помощью электронной таблицы Excel-97, результаты обобщались в таблицах и диаграммах.

Результаты и обсуждение

В подавляющем большинстве случаев невусы развивались у пациентов в возрасте от 18 до 82 лет независимо от пола (таблица).

Таблица. Проточно-цитометрическое исследование при диагностике невусов

В результате сравнительного анализа общих клеточных фаз гигантоклеточного, шаровидного, эпителиоидного, внутридермального, смешанного и пограничного невусов обнаружено, что в фазе относительного покоя (G_{0/11,5, 2,5, 3, 3,9, 5,1, 6,6%) и пролиферационный индекс (ИП) возрастают. Нужно отметить, что при проточной цитометрии анеуплоидных клеток не обнаружено.})процентное соотношение клеток уменьшается (соответственно 94, 92, 90, 87, 82,5, 80,5%), а в фазе премитоза (G2+M) количество клеток (соответственно

Гистологически меланома характеризуется выраженным клеточным и структурным полиморфизмом. Морфологическое разнообразие можно наблюдать в одной и той же опухоли. В меланоме поверхностно распространенного типа в первой фазе в эпидермисе отмечается атипическая меланоцитарная дисплазия. Вокруг опухолевых клеток, расположенных в сосочковом слое дермы, имеется выраженная лимфоидно-плазмоцитарная инфильтрация с примесью макрофагов. Во второй фазе вертикального роста опухолевые клетки обнаруживаются в ретикулярном слое дермы. Опухолевые клетки выглядят как эпителиоподобные, типа невусных, веретенообразных.

Меланома типа злокачественного лентиго характеризуется атипичной лентигиозной меланоцитарной дисплазией эпидермиса. Клетки могут быть большими и эпителиоподобными.

Узловая форма – форма опухоли, имеющая одну фазу вертикального роста, при которой наблюдается инвазия опухолевых клеток в дерму и подкожную клетчатку. Клетки могут иметь вид эпителиоподобных, ветеренообразных, типа невусных и др. Количество митозов варьирует. Клеточная реакция может быть выражена слабо или полностью отсутствует. Многослойный плоский эпителий не проявляет меланоцитарной активности, но часто имеются его реактивные разрастания в виде акантотических тяжей и «отграничивающих опухолевый узел» в виде псевдокарциноматозной гиперплазии. Опухоль этого типа не имеет распространенной пигментации на прилежащих участках.

Клеточный состав всех разновидностей меланом разнообразен. Среди них выделены: а) эпителиоподобные, разной величины пластинчатые клетки от небольших с округлым ядром; б) веретенообразные клетки; в) невусоподобные; г) гигантские.

В наших исследованиях 5-летняя выживаемость в зависимости от типа меланом составила: при лентиго-меланоме – 26%; при поверхностно-распостраняющейся – 29,6%; при узловой форме – 44,4%.

Поверхностно-распространенная форма меланомы проточно-цитометрическими методами обследована у 46 пациентов. В результате клеток, находящихся в G_0/1фазе, выявлено – 52,1%, пролиферирующих клеток в С-фазе – 16,2%, G2+M фазе – 29,5%. Индекс пролиферации был резко повышен и составил 42,6%, индекс ДНК при данной патологии – 4,5%. Анеуплоидных клеток в среднем обнаружено 80,9% от массы всех клеток опухоли. Аналогичные изменения наблюдались и при лентиго-меланоме (8 пациентов): 50,6% клеток, находящихся в G_0/1фазе, 18% клеток, пролиферирующих в С-фазе, 30,4% клеток в G2+M фазе. Индекс пролиферации также резко повышен – 44,5%, индекс ДНК – 5,5%. Анеуплоидные клетки при лентиго-меланоме в среднем составляют 81% от массы всех клеток опухоли.

Еще более углубленные изменения наблюдались при узловом варианте меланомы – обследованы 16 пациентов. При узловой форме меланомы количество клеток, находящихся в G_0/1фазе, составляет 48,1%, пролиферирующих клеток в С-фазе – 18,3%, в G2+M фазе – 30,6%. Индекс пролиферации резко повышен – 47%, индекс ДНК – 5,6%. Анеуплоидные клетки в среднем составляют 83,1% от массы всех клеток опухоли.

Заключение

Полученный фактический материал свидетельствует, что определение гистогенетического источника, диагностика и прогнозирование меланом возможны и целесообразны только на основе анализа всего комплекса признаков, максимально отражающих специфику опухолевых клеток.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Полетаев А.И. Проточная цитометрия и сор-тировка в цитологии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицине. – М.: ВИНИТИ, 2009. – 87 с.

2. Соколова С.В. Клиническая дифференциальная диагностика меланоцитарных невусов кожи с применением метода поверхностной дерматоскопии: автореф. дис. ... канд. мед. наук. – М., 2005. – 176 с.

3. Фрадкин С.3., Залуцкий И.В. Меланома кожи: практ. пособие для врачей. – Минск: Беларусь, 2000. – 221 с.

4. Коровин С.И., Гулак Л.О., Федоренко З.П. и др. // Онкология. – 2010. – Т. 12. – С. 46–52.

5. Casson P.R., Robins P., Garthy G.M., Sanders W.B.  // Plastic. Surgery. – 2010. – Vol. 5. – P. 3615–3662.

6. Davis B.H., Bigelow N., Ball E.D. et al. // Am. J. Hematol. – 2009. – Vol. 32. – P. 81–87.

7. Garratty G., Arndt P.A. // Cytometry. – 2009. – Vol. 38. – P. 259–267.

8. Hanson C.A., Hurtubise P.E. Flow cytometry and clinical diagnosis. – Chicago: ASCP Press, 2004. – 664 p.

Медицинские новости. – 2015. – №12. – С. 44-46.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.