Хламидийные инфекции – это целая группа заболеваний антропонозной и зоонозной природы, обусловленных облигатными внутриклеточными патогенными микроорганизмами.
Различные представители семейства Chlamydiaceae вызывают заболевания человека и животных, известные под общим названием «хламидиозы». Наиболее распространенные хламидиозы человека, вызываемые Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae (биовар TWAR), носят антропонозный характер. С.trachomatis вызывает у человека трахому, урогенитальные заболевания (уретрит, цервицит, эндометрит, простатит, орхит и др.), некоторые формы артрита, конъюнктивит, пневмонию. C.pneumoniae рассматривается в основном как возбудитель заболеваний респираторного тракта человека, вызывая синуситы, острые бронхиты и пневмонии. В последнее время накоплены данные, свидетельствующие о возможной связи C.pneumoniae с развитием атеросклероза, бронхиальной астмы и некоторых заболеваний центральной нервной системы.
Ряд других видов хламидий (Сhlamydophila psittaci, С. pecorum, C. caviae, C. abortus, C. felis и др.) является причиной зоонозных заболеваний (атипичной пневмонии, энцефаломиокардита, артрита, конъюнктивита, пиелонефрита и др.). Заражение людей происходит при контакте с больными домашними животными и птицами.
Таким образом, хламидиозы характеризуются разнообразием клинических симптомов и могут сопровождаться тяжелыми поражениями различных органов и систем человека и животных.
Все хламидии имеют общий групповой, родоспецифичный антиген (липополисахаридный комплекс – lipopolisacharid (LPS)), который находится на внутренней мембране. В нее интегрированы полиморфные белки наружной мембраны (Polymorphic Outer Мembrane proteins — POMPs). На основной белок наружной мембраны хламидий — Majour Outer Membrane Protein (МОМР или ОМР-1) приходится 60% общего количества белка. Он включает четыре вариабельных домена (VD1,VD2,VD3,VD4), в которых расположены видо- и серотипспецифические антигенные детерминанты. Оставшаяся антигенная структура представлена белками, богатыми цистеином (OmcA и OmcB), и белками наружной мембраны второго типа — ОМР-2. В них имеются области с высоким сходством среди видов (родоспецифические эпитопы), что обусловливает возможность появления перекрестных реакций. Поверхностные антигены играют важную роль во многих жизненных функциях хламидий (вирулентность, инвазивность, ингибирование лизосомальной активности клетки, токсичность).
Глобальное распространение заболеваний, обусловленных хламидиями, трудности терапии, частые осложнения свидетельствуют о необходимости разработки профилактической и лечебной вакцин для этой инфекции [6, 10, 30, 33]. В ряде стран мира ведутся широкомасштабные исследования биологических свойств штаммов C.trachomatis, С.pneumoniae и С.psittaci с целью получения протективного противохламидийного иммунитета [18, 37, 47]. Разработка любой вакцины является сложным процессом и требует хорошего знания свойств инфекционного агента и закономерностей развития иммунного ответа организма на инфекцию, вызываемую данным микроорганизмом. Во многих исследованиях для изучения механизмов, лежащих в основе иммунопротекции, проводится моделирование хламидийной инфекции на лабораторных животных. При этом изучаются как неспецифические, так и специфические факторы защиты [12, 24, 36].
Неспецифическую резистентность организма обеспечивает система фагоцитов, комплемента, естественных киллеров, лизоцима, интерферонов и других медиаторов воспаления. Бактерицидное действие фагоцитов осуществляется за счет локального закисления в фагосомах и «кислородного взрыва», образования активных форм кислорода (свободных радикалов, ионов, перекиси), окиси азота, ферментов. Естественные киллеры вызывают гибель клеток-мишеней с помощью протеаз, проникающих в них через образующиеся при контакте клеток поры. Система комплемента работает по классическому (каскадному) или альтернативному пути и способствует фагоцитозу и разрушению клеток. Механизмы неспецифической резистентности организма и специфические факторы защиты тесно взаимодействуют. Фагоцитоз, система комплемента, медиаторы воспаления крайне важны для развития и проявления гуморального и клеточного иммунитета. Наоборот, эффекторные механизмы специфического иммунитета (антитела, медиаторы), образованные иммунными лимфоцитами и т.п.) в значительной степени усиливают неспецифическую резистентность.
Однако в процессе эволюции хламидии адаптировались к внутриклеточному существованию и выработали ряд приспособительных реакций, позволяющих им избегать защитных систем хозяина.
Элементарные тельца (ЭТ) хламидий располагаются в вакуолях, окруженных мембраной, защищающей их от действия лизоцима. ЭТ способны также продуцировать антилизосомальные ферменты, которые препятствуют перевариванию содержимого фагосомы (незавершенный фагоцитоз) клетки хозяина. Это способствует циркуляции возбудителя по лимфо- и кровотоку и персистенции. За счет угнетения активности системы комплемента и снижения выработки белков С3а и С5а уменьшается высвобождение медиаторов из тучных клеток и снижается хемотаксис полиморфноядерных лейкоцитов в очаг воспаления.
Гуморальный специфический иммунный ответ характеризуется выработкой специфических противохламидийных антител IgM, IgG, IgA. Первоначально идет локальное образование секреторного IgA (sIgA) во входных воротах. Затем последовательно возникают антитела IgM, IgA, IgG против родоспецифических хламидийных липополисахаридов. Уже через 48 часов после заражения можно обнаружить IgM, его количество достигает максимума к 4—6-му дню, после чего начинает снижаться. В это же время или с небольшой задержкой (2—3 недели) могут быть определены IgG. Специфические IgG находятся как в сосудистом русле, так и в секретах организма (период полураспада – 23 дня). Продуцирование IgА может происходить в течение 10 дней после появления симптомов заболевания. Насчет сроков образования антител против МОМР белка мнения противоречивы. Считается, что IgG к МОМР белку хламидий определяются только через 4—8 недель после начала болезни.
Однако в процессе L-трансформации может происходить изменение антигенных свойств поверхностных структур и цитоплазматической мембраны хламидий, что позволяет ускользать C.trachomatis от ранее наработанных иммунной системой специфических антител. У ревертантов восстановление клеточной стенки происходит лишь частично, что делает данный микроорганизм некоторое время неузнаваемым для иммунологического контроля и синтезированных антител – так происходит мимикрия возбудителя.
В ряде работ продемонстрирована важность стимулирования гуморального иммунного ответа при вакцинации. Рассмотрены некоторые возможные прямые и опосредованные механизмы, обусловливающие выработку высоких титров противохламидийных антител. Известно, что секретируемые В-клетками антитела нейтрализуют инфекционность хламидий и блокируют прикрепление возбудителя к эпителиальным клеткам. Этот защитный механизм подтвержден исследованиями, проведенными в условиях как in vitrо, так и in vivo [18, 24, 30, 31]. В экспериментах был показан другой механизм, при котором специфические антитела способствуют разрешению внутриклеточной инфекции за счет антителозависимого клеточного цитотоксического действия [31]. Кроме того, В-лимфоциты являются важными антигенпрезентирующими клетками в процессе образования Т-клеток памяти [29].
Наши исследования также подтверждают важность гуморального иммунитета. Установлено, что в мазках-соскобах пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией чаще отмечаются единичные лейкоциты в уретре. Отсутствие клеток воспалительного ряда косвенно может указывать на главенствующую роль гуморального звена в формировании протективного ответа. Поэтому разрабатываемая вакцина, по нашему мнению, должна обеспечивать эффективную стимуляцию В-клеточного звена иммунитета.
Т-клеточные механизмы иммунитета. Тем не менее необходимо учитывать, что в ряде исследований показана значимая роль в иммунном ответе Т-клеточного звена, в частности CD4+Th1-лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов [28, 31, 41]. Клеточный иммунный ответ представляет собой сложную, многокомпонентную, кооперативную реакцию иммунной системы, индуцированную чужеродным антигеном. Сначала антиген подвергается переработке (процессингу) антигенпрезентирующими клетками. Пептиды (Т-клеточные эпитопы) в комплексе с молекулами 2 класса антигенпрезентирующих клеток презентируются клонам разных субпопуляций антигенспецифических Т-лимфоцитов. В результате образуются эффекторные (Т-киллеры, Т-эффекторы), регуляторные (Т-хелперы, Т-супрессоры) Т-лимфоциты и Т-клетки памяти. Эффекторные механизмы направлены на элиминацию антигена, а регуляторные контролируют интенсивность и направление реакции (стимулируют, супрессируют). Ключевой регуляторной и эффекторной популяцией Т-лимфоцитов являются CD4+Т-клетки-хелперы. Они играют существенную роль в гуморальном и клеточном иммунитете и подразделяются на различающиеся по функции CD4+Th1 и CD4+Th2 субтипы. В активированном состоянии CD4+Th1 синтезируют ряд цитокинов: интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерферон-гамма (ИФН-γ), фактор некроза опухоли-бета (ФНО-β), активирующие макрофаги, цитотоксические Т-лимфоциты и естественные киллеры, т.е. обусловливают развитие Т-зависимого клеточного иммунитета. Данное звено иммунного ответа отвечает за интенсивность реакций гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), противоинфекционную и противоопухолевую резистентность. Клеточная цитотоксичность и цитокин-опосредованная функция – это два, на наш взгляд, наиболее значимых механизма участия CD4+Th1-клеток в процессе элиминации хламидий. В экспериментах было получено подтверждение того, что цитолиз инфицированных клеток через апоптоз может являться важным механизмом устранения возбудителя. На важность Т-клеточного звена в элиминации хламидий указывают факты развития гранулярного цистита у детей.
В ряде экспериментов также была изучена роль СD8+Т-клеток (Т-киллеров) в иммунном ответе [18, 21, 26]. Учитывая облигатный внутриклеточный образ жизни хламидий, антигенспецифический СD8+Т-клеточный цитолиз также является важным механизмом в защитном иммунитете. В активированном состоянии СD8+Т-клетки синтезируют растворимый фактор, ингибирующий пролиферативный ответ антигенспецифических клонов Т- и В-лимфоцитов, угнетают функцию антигенпрезентирующих клеток. Таким образом, СD8+Т-клетки взаимодействуют с инфицированной клеткой и при этом продуцируют гранзимы и перфорин, обусловливающие лизис клеток. Более того, цитотоксические CD8+Т-лимфоциты участвуют в регуляции иммунного ответа за счет секреции провоспалительных цитокинов, прежде всего ИЛ-2, ИФН-γ, ФНО-α.
Цитокины. Цитокины – растворимые белки, выделяемые моноцитами или лимфоцитами и регулирующие интенсивность воспалительной либо иммунной реакции. Цитокины можно подразделить на несколько групп: интерфероны (ИФН α, β, γ), факторы некроза опухолей (ФНО α и β) и интерлейкины (ИЛ-1 – ИЛ-10).
Экспериментальные данные о влиянии цитокинов на хламидийную инфекцию свидетельствуют о том, что такие цитокины, как ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНО-α, имеют большое значение в элиминации возбудителя из организма.
Существенная роль в освобождении генитального тракта от инфекции, вызванной C.trachomatis, отводится интерферонам и в первую очередь ИФН-γ [24, 27, 36, 47]. Как известно, ИФН-γ вырабатывается главным образом активированными CD4+Th1-лимфоцитами, обладает противовирусной, тумороцидной и иммуномодулирующей активностью. Предполагают, что участие ИФН-γ может включать как иммунорегуляторный, так и нерегуляторный механизм. Иммунорегуляторная функция ИФН-γ, продуцируемого CD4+Th1-клетками, заключается в активации антигенспецифических цитотоксических клеток. Однако, по мнению ряда ученых, более вероятным кажется непосредственное воздействие ИФН-γ на инфицированные клетки. Наибольшее внимание исследователей получили две функции ИФН-γ. Это индукция синтетазы, участвующей в образовании оксида азота, и триптофан-разрушающего фермента индоламин 2,3-диоксигеназы. Установлено, что снижение внутриклеточного триптофанового пула в результате активации фермента индоламин 2,3-диоксигеназы приводит к ингибированию размножения хламидий, которые, как известно, являются ауксотрофами по триптофану [18]. Исходя из вышеизложенного стимуляция образования эндогенного ИФН-γ — необходимое условие при иммунизации противохламидийной вакциной.
Таким образом, до сих пор нет единого взгляда на развитие специфического протективного иммунитета. Одни исследователи отводят доминирующую роль Т-клеточному звену, другие — В-звену, включая функцию местного гистотканевого барьера и состояние биоценоза влагалища и уретры. Однако, исходя из имеющихся данных, очевидно, что необходима вакцина, которая будет индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ.
Подходы к созданию противохламидийной вакцины. В настоящее время при создании противохламидийной вакцины используются несколько подходов.
Живая вакцина. И.И. Терских с соавт. проведены исследования по получению живой вакцины против хламидиоза (пситтакоза) человека [12]. Показана ее высокая иммуногенность и безопасность. Вместе с тем установлено, что она обладает относительно невысокой протективной активностью, имеет ограниченный срок хранения, требующий ее использования практически сразу после приготовления из-за выраженного снижения активности в два и более раз уже в течение первых 7 суток хранения. Кроме того, есть опасения по поводу возможности реверсии возбудителя. В настоящее время при разработке живых вакцин усилия исследователей направлены на изучение детерминант патогенности и получение высокоиммуногенного и стабильно репродуцирующегося штамма.
ДНК вакцина. Приоритетными являются исследования по разработке противохламидийной ДНК вакцины [19, 22, 34, 48]. Для ее создания используется бактериальная или плазмидная ДНК, содержащая гены протективных антигенов хламидий. Мыши, внутримышечно или внутриназально иммунизированные генетически сконструированной ДНК, экспрессирующей белок MOMP, были защищены от экспериментальной легочной инфекции. Однако использование подобного подхода было неэффективным в отношении генитальной хламидийной инфекции [34, 46]. Ряд исследователей связывает это с высокой вариабельностью доменов в белке МОМР. Кроме того, среди разработчиков ведутся споры вокруг безопасности ДНК конструкций. Несмотря на перечисленные сложности, преимуществом ДНК вакцин является способность индуцировать развитие полноценного иммунного ответа, характерного для живых вакцин, но без использования живого штамма возбудителя. Также установлено, что ДНК вакцины менее аллергенны по сравнению с инактивированными вакцинами.
Субъединичная вакцина. В ряде центров ведутся работы по созданию субъединичной (пептидной) противохламидийной вакцины. Для этого используют белок MOMP, хламидийные полиморфные мембранные белки (POMPs: pmp A – pmp I), липополисахарид [17, 18, 25, 41]. Ряд исследователей конструирует вакцину преимущественно на основе белка МОМР [35, 44, 47]. Это связано, во-первых, с тем, что белок как высокоиммуногенен, так и иммунодоступен в стимулировании Т-клеточного ответа и нейтрализующих антител. Во-вторых, МОМР — преобладающий поверхностный белок (60% белковой массы в наружной мембране хламидий), который экспрессируется во всех фазах цикла развития хламидий. Функционально он является как порином, так и адгезином. Однако МОМР белок подвержен антигенным изменениям. Это обеспечивает ускользание возбудителя от ранее наработанных антител. Еще одной сложностью является необходимость сохранения природной конформации белка для стимулирования в организме реактивных антител. Иммуногенность МОМР вакцины может также зависеть от ее способности повторять естественные пути антигенного процессирования и презентирования. Вероятно, поэтому попытки создать вакцину на основе данного белка пока не увенчались успехом: защитный иммунитет является частичным или не отмечается вообще. В то же время фирмой «Antex Biologics» на основе хламидийного полиморфного мембранного белка разработана и в эксперименте продемонстрирована высокая эффективность рекомбинантной субъединичной вакцины «TracVax» против C.trachomatis [15, 23]. В 2002 г. началась первая фаза клинических исследований.
Генноинженерные вакцины. Отдельные исследования направлены на конструирование векторных противохламидийных вакцин. Создание векторной вакцины основано на использовании вирусов и бактерий, в геном которых вставлены участки генетического материала C.trachomatis. Известны работы по получению противохламидийной вакцины на основе рекомбинантного полиовирусного гибрида, содержащего определенные последовательности генома хламидий [29], неинфекционного аденовируса [16] и альфавирусного репликона [39]. Вызывает интерес разработка экспериментальной вакцины с использованием безвредной генетически модифицированной вагинальной бактерии Lactobacillus spp., которая экспрессирует хламидийные белки и индуцирует защитный иммунный ответ [45].
Клеточная терапия. В настоящее время накоплены многочисленные экспериментальные и клинические данные о возможности применения клеточных вакцин на основе дендритных клеток в иммунотерапии онкологических и инфекционных заболеваний [18, 24, 26, 47]. В ряде работ было продемонстрировано, что дендритные клетки играют огромную роль в процессировании и презентировании антигенов хламидий иммунокомпетентным клеткам. При этом происходит индукция ряда цитокинов, которые способствуют развитию СD4+Th1-ответа, значимость которого обсуждалась выше. Следует подчеркнуть, что на сегодняшний день наибольший защитный иммунитет против хламидийной инфекции генитального тракта был получен при адаптивном переносе дендритных клеток, взаимодействующих ex vivo с инактивированными элементарными тельцами С.trachomatis. Такая иммунизация приводила к образованию как специфических противохламидийных антител, так и СD4+Тh1-иммунного ответа. При этом уровень защиты был эквивалентен продуцируемому при первичной инфекции [42]. Является ли этот нестандартный подход к вакцинации приемлемым для использования у людей, покажет время, но его результаты демонстрируют, что иммунизация с инактивированными хламидиями может быть достаточно эффективной.
Инактивированные вакцины. Практика показывает, что разработанные и широко применяемые инактивированные вакцины способны защитить от многих вирусных и бактериальных инфекций, например полиомиелита, гриппа, холеры, коклюша, дизентерии и др. Кроме того, они более предпочтительны с точки зрения безопасности. Поэтому многие исследователи выбрали именно этот подход для создания противохламидийной вакцины [18, 24, 38, 47].
Вакцины для животных. Особенно хорошо инактивированные противохламидийные вакцины зарекомендовали себя в ветеринарии. Российскими учеными разработана вакцина против хламидиоза сельскохозяйственных животных, содержащая в качестве антигена возбудитель хламидийного аборта штамм С.psittaci «250» [12]. Р. Х. Хамадеев с соавт. получили вакцину для специфической профилактики хламидиоза крупного рогатого скота [2]. Franc et al. создали инактивированную вакцину против энзоотического аборта овец [20]. При получении этих вакцин наиболее сложным является этап очистки биомассы хламидий от компонентов желточной оболочки куриных эмбрионов и сохранение иммуногенной активности.
Ю.Д. Караваевым разработана “Вакцина для профилактики и лечения хламидиоза сельскохозяйственных животных и пушных зверей» [3]. Первоначально высокоиммуногенный штамм C.psittaci K-8-K BИЭВ культивируют на перевиваемой клеточной линии почки сайги, далее инактивируют формалином. В качестве адъюванта в состав вакцины входят легкое минеральное масло и безводный ланолин, в некоторых вакцинах — аэросил или сапонин. Также известна «Вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза (орнитоза) птиц» [4]. В качестве антигена она содержит штамм C.psittaci (var.avis) «ДЖ-87» ВГНКИ N 23-ДЭП, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур, в качестве адъюванта – поливинилпирролидон. При трехкратной схеме введения эффективность вакцины составляет 90—93%. И.Л. Обуховым с соавт. получен штамм C.psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей [5]. Для создания вакцины суспензию культуры клеток МсСоу, инфицированной штаммом C.psittaci К-1 ДЕП, инактивируют 0,15% формалином и затем добавляют адъювант – 3% раствор гидроокиси алюминия. Вакцина является высокоиммуногенной, безвредной и эффективной при профилактике хламидиоза у кошек и пушных зверей. Также известен «Штамм бактерий C.psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза свиней» [11]. В работе используется штамм C.psittaci N14, выделенный из абортированного плода свиноматки и адаптированный к монослою фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Вакцину вводят свиноматкам внутримышечно двукратно с интервалом в 6 дней.
В Республике Беларусь сотрудниками НИИ экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского также были проведены широкомасштабные работы по поиску высокоиммуногенного и стабильно репродуцирующегося штамма с целью создания вакцины для профилактики хламидиоза у крупного рогатого скота [13]. Для этого выделен и адаптирован к культуре клеток МсСоу штамм C.psittaci КМИЭВ-36. При создании вакцины в качестве инактиватора использован теотропин (0,3%), а в качестве адъюванта – 2% суспензия активированной целлюлозы. Показана достаточно высокая эффективность этой вакцины.
Вакцины для людей. Имеются некоторые наработки по созданию инактивированной противохламидийной вакцины для людей.
Разработана аэрозольная тканевая вакцина, полученная при инактивации штамма C.psittaci «В» мертиолятом [12]. Однако необходимость использования специального оборудования для распыления, а также сложность дозирования для каждого вакцинируемого создает определенные трудности при ее широком применении.
О.А. Тимашевой и Л.И. Обориной разработан «Способ приготовления вакцины для профилактики хламидийных инфекций у человека» [1]. Сущность его за-ключается в том, что вакцину готовят из цельноклеточных антигенов штамма С.trachomatis «L2» и штамма C.psittaci «Лори». При этом подходе за счет мягких условий инактивации формалином сохраняется антигенная специфическая активность хламидийных корпускул. Обработка дифференциальным центрифугированием и эфиром повышает степень очистки и процент выхода целевого продукта. Результаты доклинических испытаний свидетельствуют о том, что предложенный способ приготовления позволяет получить вакцину расширенного спектра действия, индуцирующую в организме экспериментальных животных напряженный иммунитет при двукратной иммунизации подкожно или внутримышечно в отношении двух штаммов хламидий — C.psittaci (возбудителя зоонозных хламидиозов) и C.trachomatis (возбудителя антропонозных хламидиозов)
Роль адъювантов при конструировании вакцин. Выбор адъювантов и иммуностимуляторов является одним из актуальных моментов при создании вакцины. В арсенале разработчиков имеется целый ряд адъювантов, включая детоксифицированные конструкции холерного токсина, температурочувствительный энтеротоксин, мутантный токсин, иммуностимулирующие комплексы (искомы), липосомы, микрочастицы, интерлейкины и др. [40, 47]. Из иммуностимуляторов хорошо зарекомендовал себя полиоксидоний. Он входит в состав широко применяемых на практике герпетической вакцины и вакцины «Гриппол», находящейся на стадии клинических испытаний вакцины против ВИЧ/СПИД «ВИЧРЕПОЛ». Введение в вакцину «Гриппол» полиоксидония обеспечило повышение иммуногенности и стабильности антигенов, иммунологической памяти, существенно (примерно в 3 раза) снизило прививочную дозу антигенов
Полиоксидоний (ПО) представляет собой физиологически активное соединение с молекулярной массой 100 кДа, обладающее выраженной иммуномодулирующей активностью. По химической структуре это сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиэтил-1,4-этиленпиперазиния бромида с молекулярной массой 80 кДа [7, 14]. Препарат оказывает влияние на все звенья защиты организма от чужеродных антигенов, повышая пониженные и понижая повышенные показатели иммунитета. Мишенями для него являются прежде всего факторы естественной резистентности: моноциты/макрофаги, нейтрофилы и нормальные киллеры — факторы ранней защиты организма от инфекции. При взаимодействии с мононуклеарами периферической крови человека полиоксидоний усиливает цитотоксичность нормальных киллеров, но только в том случае, если она была исходно понижена. На нормальные уровни цитотоксичности лимфоцитов он влияния не оказывает. Кроме того, ПО может стимулировать или вызывать костимулирующий эффект в отношении продукции клетками цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α и ИФН-γ. Вероятно, усиление полиоксидонием продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-α лежит в основе его способности повышать антиинфекционную резистентность организма, так как эти цитокины являются одними из главных активаторов функциональной активности фагоцитарных клеток [8]. Чрезмерное усиление образования провоспалительных цитокинов опасно для организма, поскольку они могут быть причиной тяжелых патологических процессов. Поэтому важными, на наш взгляд, являются данные об индукции полиоксидонием синтеза ИЛ-6, который в свою очередь обладает способностью подавлять образование провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-α, т. е. ИЛ-6 является одновременно и провоспалительным, и противовоспалительным цитокином. Таким образом, в отношении индукции синтеза цитокинов ПО выступает как истинный иммуномодулирующий препарат.
Другим важным свойством полиоксидония является его способность существенно усиливать антителообразование. При введении совместно с низкими дозами антигена ПО усиливает антителообразование в 5—10 раз [8, 14]. Помимо иммуномодулирующего и антителостимулирующего эффекта полиоксидоний характеризуется наличием детоксицирующей, антиоксидантной и мембраностабилизирующей активности.
Собственные разработки противохламидийной вакцины. Нами были проведены исследования по созданию инактивированной противохламидийной вакцины, в состав которой входит иммуностимулятор полиоксидоний. Выбор именно этого подхода основан на том, что такого рода вакцины слабо реактогенны и невозможна реверсия в исходный патогенный штамм. Важным преимуществом является то, что в вакцине сохраняется полный набор антигенов возбудителя (МОМР, LPS, PОМРs и др.). Необходимость всех этих антигенных детерминант хламидий в стимулировании иммунного ответа продемонстрирована в работе Н. Su et al. [43].
Cуть нашей разработки заключается в том, что вакцину готовят из цельноклеточных антигенов авторского штамма С.trachomatis МТ-2А, депонент НКВ-NХ3-3 (Заявка на патент N а20050184 от 25.02.05) [9—11]. Данный штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток МсСоу (прошел 18 пассажей). Титр возбудителя составляет 5,5lgЦПД50/мл. ДНК штамма С.trachomatis МТ-2А содержит фрагменты tet-M и tet-O генов, т.е. устойчив к тетрациклинам и не имеет нуклеотидных последовательностей erm-генов, т.е. чувствителен к макролидам. Концентрация ДНК штамма С.trachomatis МТ-2А при титре 5,5lgЦПД 50/мл составляет 1,7х106 копий/мл. Культивирование проводят на культуре клеток МсСоу, взвесь хламидий инактивируют формалином, очищают дифференциальным центрифугированием и эфирной обработкой.
В ходе работы по созданию инактивированной противохламидийной вакцины первоначально проведен скрининговый поиск различных инактиваторов (формалин, препарат–В), адъювантов (адъювант Фрейнда, гидроокись алюминия, полиоксидоний) и исследована в эксперименте эффективность 3- и 7-кратной иммунизации. Установлено, что при 7-кратной схеме иммунизации (интервал 7 дней) с использованием формалина в качестве инактиватора и адъюванта Фрейнда титры противохламидийных антител в реакции непрямой гемагглютинации достигали значения 4693,3±426,7, при 3-кратной схеме иммунизации (интервал 21 день) без адъюванта и в сочетании с полиоксидонием — 1707±341,3, и 5461±1365,3 соответственно.
Таким образом, в основе создаваемой нами экспериментальной инактивированной противохламидийной вакцины лежит комбинированный подход, заключающийся в одновременном введении инактивированного формалином хламидийного антигена и полиоксидония. Вакцину вводят трехкратно с интервалом 21 день. Одна доза вакцины содержит 0,5 мл (50 мкг белка) и 0,02 мкг полиоксидония (ООО «Иммафарма», РФ). В дальнейших экспериментах было показано, что разработанная вакцина безвредна, нетоксична и обладает выраженной иммуногенной активностью. Титр противохламидийных антител класса IgG после третьей иммунизации достигает значения 10880±1817,76 (РЈ0,05).
Экспериментальная вакцина не только индуцирует выработку антител, но и вызывает стимуляцию Т-клеточного звена иммунитета. При оценке функционального состояния Т-лимфоцитов у вакцинированных животных по реакции бласттрансформации лимфоцитов отмечено повышение их функциональной активности до 29,3±2,8% по сравнению с контролем (10,7±1,9%). Кроме того, при повторном введении противохламидийной вакцины в лапку мышей формировалась гранулема, т.е. отмечалось развитие реакции по механизму гиперчувствительности замедленного типа. Как известно, ГЗТ – это состояние повышенной чувствительности, индуцированное антигенами, содержащими Т-клеточные эпитопы. При этом в тканях возникают реакции пролиферативного и цитотоксического типа. Вакцина вызывает сенсибилизацию организма и дифференцировку антигенспецифических Т-лимфоцитов, преимущественно СD4+Th1-клеток. Иммунологическая фаза реакции развивается вследствие повторного внутрикожного введения хламидийного антигена. Данная реакция обусловливается активацией и ответом антигенспецифических CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов. Проявляется она через 24—72 ч (поэтому называется замедленной). Во время патохимической фазы антигенспецифические клоны Т-лимфоцитов продуцируют медиаторы клеточного иммунного ответа – хемотаксический фактор, фактор активации макрофагов (ИФН-γ), ИЛ-2, фактор, угнетающий миграцию макрофагов и др. При патофизиологической фазе мононуклеарные лейкоциты (лимфоциты, моноциты, макрофаги) мигрируют в место локализации антигена. Клоны антигенспецифических Т-лимфоцитов, активированные антигеном, локально развивают Т-зависимый клеточный иммунный ответ, что сопровождается формированием инфильтрата и гранулемы. Иммунологическое повреждение реализуется в результате прямого цитотоксического действия на клетки-мишени CD8+Т-клеток и формирования воспаления CD4+Т-клетками. Таким образом, выявленная положительная реакция ГЗТ свидетельствует о том, что введение экспериментальной вакцины влияет на продукцию сенсибилизированными Т-лимфоцитами медиаторов воспаления и, как следствие, на включение Т-клеточного звена иммунного ответа.
Итак, доклинические испытания показали, что разработанная экспериментальная противохламидийная вакцина c полиоксидонием эффективна в выработке как гуморального, так и клеточного иммунитета. На следующем этапе необходимо наладить производство в соответствии с международными стандартами GMP, провести клинические испытания среди добровольцев. Перспективными, на наш взгляд, являются исследования по созданию интравагинальной вакцины и оценка ее эффективности.
Во всем мире активно ведутся работы по получению протективного противохламидийного иммунитета. Какой из разрабатываемых подходов будет наиболее эффективным, покажет будущее, а пока нет оптимальной вакцины, прошедшей все этапы клинических испытаний и официально разрешенной для проведения специфической профилактики и лечения хламидиозов у людей.
Литература
1. Патент 2242993 RU С2, МКИ 7А61К 39/118 / Тимашева О.А., Оборина Л.И. // Описание изобретения к патенту Российской Федерации. – 2004.— N 36. – 8 с.
2. Патент 2092188 RU С1, МКИ 6А61К 39/118 / Хамадеев Р.Х., Равилов А.З., Хусаинов Ф.М., Беклешова А.Ю. // Описание изобретения к патенту Российской Федерации. – 1997. — 9 с.
3. Патент 2085213 RU С1, МКИ 6А61К 39/118 / Караваев Ю.Д. – 3 с.
4. Патент 2125465 RU С1, МКИ 6А61К 39/118 / Данченко Г.Н. и др.—13 с.
5. Патент 2122579 RU С1, МКИ 6А61К 39/118 / Обухов И.Л., Груздев К.Н., Кумалагова К.И. – 6 с.
6. Патент 1405300 SU, МКИ 6А61К 39/118 / Щербань Г.П., Кравченко Т.Ф., Деркачева Р.В. —6 с.
7. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Некрасов А. В. и др. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. — 1999. — N 3. — С. 3—6.
8. Пинегин Б.В., Некрасов А.В., Хаитов Р.М. // Цитокины и воспаление. – 2004. — N 3. – С. 23—25.
9. Полещук Н.Н., Капитулец Н.Н., Рубаник Л.В. // Сб. тез. междунар. конф. «Микробиология и биотехнология XXI столетия». — Мн., 2002. – С. 261.
10. Полещук Н.Н., Капитулец Н.Н., Рубаник Л.В. и др. // Здравоохранение. – 2005. — N 11. – С.46—50.
11. Полещук Н.Н., Капитулец Н.Н., Рубаник Л.В., Титов Л.П. // Сб. тез. междунар. конф. “Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний”. – Сосновка (Новосибирск. обл.), 2004. — С.268—269.
12. Терских И.И. Орнитоз и другие хламидийные инфекции.— М.: Медицина, 1979.
13.Фомченко И.В. Хламидиоз крупного рогатого скота (диагностика, специфическая профилактика): Автореф. дис. … канд. ветерин. наук. – Мн., 2002.
14. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. // Клин. медицина.— 1996. — N 8.— С. 7—12.
15. Antex Biologics / Press release, 3 Febr. 2003.
16. Babiuk L. A., Tikoo S. K. // J. Biotechnol. – 2000. – V. 83. – P. 105—113.
17. Brunham R.C., Zhang D.J., Yang X., McClarty G.M.// J. Infect. Dis.—2000. — V. 181. — P.538—543.
18. Chlamydia. Intracellular Biology, pathogenesis and immunity / Stephens R.S. — Washington, 1999.
19. Dong-Ji Z., Yang X., She C. еt al. // Infect. Immun.— 2000. – V. 68. – P. 3074–3078.
20. Entrican G., Buxton D., Longbottom D. // J. of the Royal Society of Medicine. — 2001. — V. 94. — P.273—277.
21. Fling S.P., Sutherland R.A., L.N. Steele et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2001. —V.98.—P.1160—1165.
22. Gurunathan S., Klinman D. M., Seder R. A. // Annu. Rev. Immunol. – 2000. – V. 18. —P. 927–974.
23. Igietseme J.U., Black C.M., Caldwell H.D. // BioDrugs. – 2002. – V. 16, N 1. – P.19—35.
24. Igietseme J.U., Murdin A. // Infect. Immun. — 2000. — V.68. — P.6798—6806.
25. Igietseme J.U.// J. Jmmunol. — 2000. — V.164. — P.4212—4219.
26. Johansson M., Ward M., Lycke N. // Immunology. – 1997. – V.92. —P.1032 — 1044.
27. Johansson M., Schon K., Ward M.E., Lycke N. // Scand. J. Immunol. — 1997. — V.46. — P.546—552.
28. Lampe M.F., Wilson C.B., Bevan M.J., Starnbach M.N. // Infect. Immun. – 1998. – V. 66. – P. 5457—5461.
29. Linton P.J., Harbertson J., Bradley L.M. // J. Immunol. – 2000. – V.165. – P.5558—5565.
30. Morrison R.P., Caldwell H.D. // Infection and Immunity. – 2002. – V.70, N 6. – P.2741–2751.
31. Morrison S.G., Caldwell H.D., Morrison R.P. // Infect. Immun.— 2000. — V.68. — P.6979 —6987.
32. Murdin A. D., Su H., Klein M. H., Caldwell H. D. // Infect. Immun. — 1995. –V.63. – P.1116—1121.
33. Paavonen J. // Sex. Transmit. Infect. – 2001. — V. 77. – P.154—156.
34. Pal S., Barnhart K.M., Wei Q. et al. // Vaccine. – 1999. – V.17. – P.459 — 465.
35. Pal S., Theodor I., Peterson E. M., de la Maza L. M. // Infect. Immun. – 1997. – V. 65. – P.3361–3369.
36. Perry L.L., Feilzer K., Caldwell H.D. //J. Immunol. – 1997. – V. 158. – P. 3344—3352.
37. Ramsey K.H., Cotter T.W., Salyner R.D. et al.// Infect. Immun. — 1999. — V.67. — P.3019—3025.
38. Rank R.G., Batteiger B.E., Soderberg L.S.// Infect. Immun. – 1990. —V. 58, N 8. – P.2599—2605.
39. Schlesinger S., Dubensky T. W. // Curr. Opin. Biotechnol. — 1999. – V. 10. – P. 434—439.
40. Singh M., O’Hagan D. // Nat. Biotechnol. — 1999. – V. 17. – P. 1075—1081.
41. Stephens R. S. // Science. – 1998. – V. 282. – P.754—759.
42. Su H., Messer R., Whitmire W. et al. // J. Exp. Med. – 1998. – V. 188. – P.809—818.
43. Su H., Messer R., Whitmire W. et al. // Infect. Immun. — 2000. – V.68. — P.192—196.
44. Su H., Parnell M., Caldwell H. D. // Vaccine. – 1995. – V.13. – P.1023–1032.
45. Turner M.S., Giffard P.M. // Infection and Immunity. – 1999. – V.67. – P.5486–5489.
46. Vanrompay D., Cox E., Vandenbussche F. et al. // Vaccine. — 1999. – V.17. – P. 2628–2635.
47. Ward M.E. // Cell and Mol. Medicine. — 2000. — V.54. — P.34—37.
48. Zhang D., Yang X., Berry J. et al.// Infection. J. Infect. Dis. — 1997. —V.176. — P.1035—1040.
Медицинские новости. – 2006. -№11. – С. 29-35.
Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.