Krivenko S.I.¹, Gapanovich V.N.², Rasyuk E.D.³

¹9th City Clinical Hospital, Minsk, Belarus

^{2Republican Unitary Enterprise «LOTIOS Scientific and Practical Center», Minsk, Belarus}

³Republican Scientific and Practical Center for Transfusiology and Medical Biotechnologies, Minsk, Belarus

Influence of drug substance Fruglyumin on secondary hemostasis indicators of blood plasma and factor VIII activity in cryoprecipitate

езюме. В исследованиях, выполненных на 31 образце криопреципитата групп 0 (I) (n = 10), А (II) (n = 12) и В (III) (n = 9) с титром изогемагглютининов альфа ?1:4÷1:64 и титром изогемагглютининов бета ?1:2÷1:16 оценивали эффективность связывания альфа - или бета-изогемагглютининов группоспецифическими полисахаридами (ГП) (субстанции иммуномодулирующих лекарственных средств «Фруглюмин А» и «Фруглюмин Б») и их влияние на активность фактора VIII. Оценку влияния ГП на показатели системы гемостаза проводили в параллельных постановках контрольных (с 0,9% раствором натрия хлорида) и опытных (с ГП) проб на 26 образцах бестромбоцитарной плазмы крови А (II) и В (III) групп. Внесение ГП в плазму крови не приводило к изменению величин показателей вторичного гемостаза (активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, тромбиновое время), но обеспечивало полное связывание соответствующих изогемагглютининов в плазме крови. ГП также не оказывали влияния на активность фактора VIII при полной нейтрализации изогемагглютининов в криопреципитате. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования лекарственных средств «Фруглюмин А» и «Фруглюмин Б» для универсализации в системе АВ 0 криопреципитата и свежезамороженной плазмы на этапе их производства.

Ключевые слова: изогемагглютинины, плазма крови, вторичный гемостаз, фактор VIII, криопреципитат, группоспецифические полисахариды, фруглюмин.

Медицинские новости. – 2015. – №6. – С. 70–72.

Summary. In studies carried out on 31 sample cryoprecipitate groups 0 (I) (n = 10), A (II) (n = 12) and B (III) (n = 9) with alpha-isohemagglutinins titer of 1:4÷1:64 and beta-isohemagglutinins titer of 1:2÷1:16 evaluated efficiency of binding alpha- or beta -isohemagglutinins with group-specific polysaccharides (GP) (substances of immunomodulatory drugs «Fruglyumin A» and «Fruglyumin B») and their effect on the activity of factor VIII. Assessing the impact of GP on hemostatic parameters were carried out in parallel controls (0.9% sodium chloride) and experienced (with GP) productions on 26 samples of blood plasma A (II) and В (III) groups. Adding to the GP in the blood plasma did not change the values of parameters of the secondary hemostasis (APTT, PT and TТ), but provides a complete binding appropriate isohemagglutinins in blood plasma. GP also had no effect on the activity of factor VIII with complete neutralization isohemagglutinins in cryoprecipitate. The results suggest the possibility of using drugs «Fruglyumin A» and «Fruglyumin B» for universalization in the AB 0 cryoprecipitate and fresh frozen plasma during their production.

Keywords: isohemagglutinins, plasma, secondary hemostasis, factor VIII, cryoprecipitate, group-specific polysaccharides, fruglyumin.

Meditsinskie novosti. – 2015. – N6. – P. 70–72.

Применение в клинической практике большинства компонентов и препаратов крови, в том числе свежезамороженной плазмы (СЗП) и криопреципитата, осуществляется с учетом их групповой принадлежности в системе АВ 0.

В состав криопреципитата входит коагуляционный фактор VIII и фибриноген, что определяет его широкое использование в качестве заместительной терапии при кровотечениях (повышенной кровоточивости) вследствие врожденного или приобретенного дефицита данных факторов свертывания. СЗП содержит весь комплекс лабильных и стабильных компонентов свертывающей системы.

При оказании экстренной медицинской помощи нередки случаи относительного дефицита криопреципитата и СЗП. Это объясняется необходимостью использования большого количества данных гемопродуктов для достижения терапевтического эффекта. Неравномерность распределения людей по группам крови в популяции приводит к недостатку гемокомпонентов и препаратов крови наиболее редко встречающихся групп – В (III) и АВ (IV) [1, 5].

В клинической трансфузиологии дефицит гемокомпонентов и препаратов крови определенной группы усугубляется в ситуациях, когда в силу различных причин определение группы крови пациента невозможно. Так, неспецифическая агглютинация, когда эритроциты агглютинируются сыворотками всех групп, включая AB (IV), наблюдается при аутоиммунной гемолитической анемии и других аутоиммунных заболеваниях, при гемолитической болезни новорожденных [6, 7].

Установление группы крови затруднено и у пациентов с кровяными химерами, когда одновременно в кровяном русле пребывает две популяции эритроцитов, отличающихся по группе крови и другим антигенам. Трансфузионные химеры возникают в результате многократного переливания эритроцитной массы группы 0 (I) реципиентам другой группы. Истинные химеры встречаются у гетерозиготных близнецов, а также после аллогенной трансплантации костного мозга от иногруппного донора [6].

Сложности в определении группы крови АВ 0 и резус-принадлежности пациента могут быть обусловлены также изменением свойств эритроцитов при различных патологических состояниях. Это может выразиться в повышенной агглютинабельности эритроцитов, наблюдаемой при циррозе печени, ожогах, сепсисе. При лейкозах, наоборот, наблюдается снижение агглютинабельности эритроцитов, в результате чего значительное их количество остается не вовлеченным в агглютинацию даже при использовании высокоактивных стандартных реагентов (ложная кровяная химера) [7].

При наличии жизненных показаний и невозможности определения группы крови пациенту переливают резус-отрицательные эритроциты группы 0 (I) и плазму группы АВ (IV), количество которой с учетом частоты встречаемости в популяции доноров группы АВ (IV) не превышает 10% от объема заготовки [6, 7].

Эффективным путем устранения подобного дефицита является удаление естественных альфа- и бета-изогемагглютининов на этапе производства различных гемопродуктов. Среди известных методов универсализации лишь нейтрализация изогемагглютининов с помощью препаратов, содержащих соответствующие группоспецифические субстанции, приемлема для получения компонентов (препаратов) крови для терапевтических целей. Однако, несмотря на актуальность данной проблемы для практического здравоохранения, в Республике Беларусь разрешенные для клинического применения методы, позволяющие нейтрализовать в гемопродуктах активность изогемагглютининов, отсутствуют.

На базе ГУ «Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий» разработана технология получения группоспецифических полисахаридов А (ПА) и группоспецифических полисахаридов Б (ПБ) из слизистых оболочек свиных и лошадиных желудков соответственно, включающая этапы ферментативного гидролиза с последующим осаждением полисахаридов и освобождением от балластных примесей. Комплексное медико-биологическое исследование свойств данных полисахаридов позволило разработать на основе полученных субстанций набор реагентов для нейтрализации альфа - и бета-изогемагглютининов и лекарственные средства «Фруглюмин А» и «Фруглюмин Б», которые, помимо основного специфического (иммуномодулирующего) действия, характеризуются присущей реагентам способностью нейтрализовать изогемагглютинины [4].

Данное свойство группоспецифических полисахаридов (субстанций лекарственных средств «Фруглюмин А» и «Фруглюмин Б») открывает перспективу их использования для нейтрализации изогемагглютининов в препаратах крови, в частности в СЗП и криопреципитате.

Цель исследования – оценка влияния субстанции группоспецифических полисахаридов А и группоспецифических полисахаридов Б на показатели свертывающей системы плазмы крови и активность фактора VIII в криопреципитате при полной нейтрализации изогемагглютининов.

Материалы и методы

О влиянии группоспецифических ПА и ПБ на параметры системы гемостаза в плазме крови и активность VIII фактора в криопреципитате судили по изменению их значений в присутствии изучаемых субстанций с одновременной регистрацией серологической активности изогемагглютининов альфа и бета, содержащихся в объекте исследования.

Основу современного исследования гемостаза составляют четыре базовых теста: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПТ), тромбиновое время (ТВ) и определение концентрации фибриногена. Они моделируют in vitro три основных механизма коагуляционного каскада: внешний, внутренний и общий пути свертывания. ПТ дает информацию о функциональном состоянии компонентов так называемой экзогенной коагуляционной системы, которая инициируется высвобождением тромбопластина из поврежденной ткани, в то время как тест АЧТВ позволяет определить статус компонентов, участвующих в эндогенной коагуляционной системе, инициирующейся контактной активацией фактора XII. Тесты ТВ и определения фибриногена позволяют судить о статусе конечного этапа свертывания [2, 3].

В работе использованы опытно-промышленные серии группоспецифических ПА (с. 020905) и ПБ (с. 301005) с активностью 0,01 у.е., что соответствует полной нейтрализации изогемагглютининов в 1 мл плазмы крови равным объемом 0,01% раствора субстанции группоспецифических полисахаридов. Указанные серии были наработаны в РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий в соответствии с ТУ BY 190572781-007.2005.

Криопреципитат получали в соответствии с регламентом производства РП 04–2007 «Криопреципитат раствор замороженный для внутривенного введения 90 ЕД в контейнере полимерном для компонентов крови».

В исследованиях, выполненных на 31 образце криопреципитата групп 0 (I) (n = 10), А (II) (n = 12) и В (III) (n = 9) с титром изогемагглютининов альфа 1:4?1:64 и титром изогемагглютининов бета 1:2?1:16, ПА и/или ПБ вносили непосредственно в криопреципитат в количестве 0,05 мл 1% раствора на 0,4 мл криопреципитата, что 10-кратно превышало концентрацию группоспецифических полисахаридов, необходимую для полной нейтрализации изогемагглютининов. Образцы криопреципитата с группоспецифическими полисахаридами инкубировали в течение 5–10 минут для определения активности фактора VIII и в течение 24 часов – для контроля активности альфа- или бета-изогемагглютининов.

Параллельно оценивали эффективность связывания альфа- или бета-изо-гемагглютининов группоспецифическими ПА и ПБ и их влияние в концентрациях, полностью нейтрализующих серологическую активность изогемагглютининов, на активность фактора VIII, определяемую по модифицированному методу Рутберга [2].

Оценку влияния группоспецифических полисахаридов на показатели системы гемостаза проводили в параллельных постановках контрольных (с 0,9% раствором натрия хлорида) и опытных (с группоспецифическими полисахаридами) проб на 26 образцах бестромбоцитарной плазмы крови групп А (II) и В (III) (по 13 образцов каждой группы), полученных от доноров крови при плановых кроводачах в РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий. Группоспецифические полисахариды вносили в плазму опытных проб в количестве 0,15 (0,30) мл 1% раствора на 1,2 мл плазмы. Конечная концентрация группоспецифических полисахаридов более чем в 10 (20) раз превышала необходимую для полной нейтрализации изогемагглютининов. Для параллельной постановки контрольной пробы в плазму добавляли соответствующее количество 0,9% раствора натрия хлорида.

Пробы инкубировали в течение 15 мин, и оценивали основные показатели системы вторичного гемостаза, регистрируя АЧТВ, ПТ и ТВ на гемокоагулометре СGL 2110 (СОЛАР, Республика Беларусь) с использованием диагностических реагентов АЧТВ-тест, Ренампластин МИЧ 1,1-1,2; Тромбин-реагент (Ренам, Россия).

Статистическая обработка результатов проведена с помощью непараметрических методов. Средние величины представлены в виде значений медианы и диапазона (25–75 процентили). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Данные по оценке стабильности основных показателей свертывающей системы крови в присутствии группоспецифических полисахаридов представлены в табл. 1.

Тпблица 1. Влияние группоспецифических полисахаридов на показатели системы гемостаза плазмы крови

 П р и м е ч а н и е : результаты представлены в значениях медианы и диапазона (25–75 процентили); R = П опыт / П контроль, где П опыт – показатель в пробе с добавлением группоспецифических полисахаридов, П контроль – показатель в пробе с добавлением 0,9% раствора натрия хлорида; р>0,05 для всех вариантов постановки.

Так, внесение группоспецифических ПА в образцы бестромбоцитарной плазмы группы В (III) с титром изогемагглютининов альфа 1:4?1:64 не изменяло определяемых в них показателей АЧТВ, ПТ и ТВ по сравнению с контрольными образцами. Так, показатель R_АЧТВ в присутствии ПА в концентрациях, 10-кратно превышающих необходимую для нейтрализации изогемагглютининов альфа, составил 1,01 (0,95–1,06), R_ПТ – 1,03 (0,99–1,07), R_ТВ – 0,99 (0,98–1,04). Увеличение количества добавляемых группоспецифических полисахаридов вдвое (20-кратное превышение дозы, обеспечивающей полную нейтрализацию изогемагглютининов) также не оказывало влияния на исследуемые показатели гемостаза.

Аналогичные результаты получены и в постановках с донорской плазмой группы А (II), содержащей изогемагглютинины? бета в титрах 1:2?1:16. Присутствие группоспецифических ПБ в количествах, как 10-, так и 20-кратно превышающих необходимую для универсализации компонентов (препаратов) крови в системе АВ 0, не оказало влияния ни на один из исследуемых показателей.

При оценке эффективности нейтрализации изогемагглютининов альфа и бета спустя 24 часа после внесения группоспецифических ПА и ПБ в исследуемых образцах плазмы крови реакция агглютинации стандартных эритроцитов групп В (III) и А (II) соответственно отсутствовала.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии влияния группоспецифических полисахаридов на показатели системы вторичного гемостаза на фоне полной нейтрализации изогемагглютининов донорской плазмы.

Криопреципитат характеризуется групповой принадлежностью в системе АВ 0, и его введение пациенту осуществляется только при условии идентичности препарата и реципиента в этой системе. В экспериментальных постановках, выполненных на 31 образце криопреципитата, установлено, что внесение группоспецифических полисахаридов в дозах, полностью нейтрализующих серологическую активность изогемагглютининов, не оказывает влияния на активность фактора VIII в нем (табл. 2).

Таблица 2. Влияние группоспецифических субстанций А и Б на активность фактора VIII в криопреципитате

П р и м е ч а н и е : результаты представлены в значениях медианы и диапазона (25–75 процентили); р>0,05 для всех вариантов постановки.

Так, исходно медиана активности фактора VIII в криопреципитате группы 0 (I) составила 134 (130–138) ЕД, в крио-преципитате групп A (II) и B (III) – 130 (125–138) ЕД. Внесение группоспецифических полисахаридов в концентрациях, обеспечивающих полную нейтрализацию изогемагглютининов, не изменяло данный показатель.

Выводы:

1. Внесение группоспецифических полисахаридов в плазму крови не приводит к существенному изменению величин показателей вторичного гемостаза (АЧТВ, ПТ и ТВ), но обеспечивает полное связывание соответствующих изогемагглютининов.

2. Группоспецифические полисахариды (субстанции лекарственных средств «Фруглюмин А» и «Фруглюмин Б») не оказывают влияния на активность фактора VIII при полной нейтрализации изогемагглютининов в криопреципитате.

3. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования лекарственных средств «Фруглюмин А» и «Фруглюмин Б» для универсализации в системе АВ 0 криопреципитата и свежезамороженной плазмы на этапе их производства.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии. – М., 2011. –1015 с.

2. Иванов Е.П. Руководство по гемостазиологии. – Мн.: Беларусь, 1991. – 302 с.

3. Козлов А.А., Берковский А.Л., Качалова Н.Д. и др. Пособие для врачей-лаборантов. Работа с оте-чественными коагулометрами и реагентами НПО «РЕНАМ». – М., 2013. – С.6–7.

4. Кривенко С.И., Гапанович В.Н. // АрсМедика. – 2012. – №13. – С.89–93.

5. Минеева Н.В. Группы крови человека. Основы иммуногематологии. – СПб., 2004. – 188 с.

6. Очерки по производственной и клинической трансфузиологии / под ред. А.И.Воробьева. – М., 2006. – 632 с.

7. Практическая трансфузиология / под ред. Г.И.Козинца. – М., 2005. – 544 с.

Медицинские новости. – 2015. – №6. – С. 70-72.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.