Methotrexate in small doses showed immunosuppressive effect on autoimmune mechanism of Diabetes Mellitus and significantly reduced the release of cytokines.

Mammadgasanov R.M., Nasrullayeva G.M., Alakberova U.N. Methotrexate influence on cytokine status of patients with autoimmune diabetes

Cахарный диабет типа I (СД I) – одно из самых распространенных и тяжелых аутоиммунных заболеваний. Исследования последнего десятилетия показали ведущую роль клеточных механизмов развития аутоиммунитета, а также гуморальных медиаторов в патогенезе и развитии сахарного диабета 1-го типа [1, 2, 9]. Цитотоксический эффект иммунной системы по отношению к собственным тканям, как и при других аутоиммунных заболеваниях, является патогенетической основой развития сахарного диабета типа I, а главный фактор иммунного поражения – аутоспецифические Т-лимфоциты [5]. Продуцируемые Т-лимфоцитами и макрофагами цитокины непосредственно участвуют в развитии местного воспаления поджелудочной железы, приводящего к поражению инсулинсинтезирующих клеток, их функциональной недостаточности и, как следствие, к развитию СД.

Дендритные клетки захватывают аутоантигены, высвобождаемые из бета-клеток, презентируют их CD4+ T-лимфоцитам, которые дифференцируется в Th1 клетки и начинают синтезировать IFNгамма, в свою очередь активирующий макрофаги. Одновременно дендритные клетки презентируют аутоантиген CD8+ T-лимфоцитам. Эти Т-лимфоциты пролиферируют под влиянием IL-2 и дифференцируются в цитотоксические Т-лимфоциты, которые и вызывают повреждение поджелудочной железы. Цитотоксические Т-лимфоциты не только вызывают цитолиз бета-клеток по перфориновому механизму, но и усиливают процесс путем индукции Fas-зависимого апоптоза. О важной роли Th1-зависимого механизма поражения бета-клеток с участием макрофагов свидетельствует тот факт, что в отсутствие макрофагов повреждение бета-клеток, обусловленное сенсибилизацией Т-клеток, значительно ослабляется. Макрофаги выделяют активные формы кислорода и азота, а также другие субстанции, цитотоксические для бета-клеток. Даже IL-1бета, синтезируемый макрофагами, является цитотоксическим агентом для бета-клеток, экспрессирующих рецепторы для этого цитокина [2, 4].

Суммируя клинические и экспериментальные данные, полученные к настоящему времени, можно представить следующую концепцию патогенеза сахарного диабета типа I. Несмотря на видимость острого начала, СД I развивается постепенно. Латентный период может продолжаться в течение нескольких лет. Клинические симптомы появляются только после разрушения 80% бета-клеток [2, 8]. При аутопсийном исследовании ткани поджелудочной железы больных сахарным диабетом типа I обнаруживаются явления инсулита – специфического воспаления, характеризующегося инфильтрацией островков лимфоцитами и моноцитами. Самые ранние стадии доклинического периода сахарного диабета типа I характеризуются появлением клонов аутореактивных Т-лимфоцитов, продуцирующих цитокины, что приводит к разрушению бета-клеток. Особого внимания заслуживает взаимодействие цитокинов IL-12 и IFNгамма при воспалительном иммунном ответе. IL-12 играет решающую роль в индукции дифференцировки Th1-клеток и стимулирует выработку этими клетками IFNгамма, один из важнейших эффектов которого – усиление выработки макрофагами IL-12. Таким образом, эти цитокины вместе с рецепторами и сигнальными путями, ответственными за экспрессию их генов, образуют единую функциональную систему, которой принадлежит ключевая роль в реализации воспалительной формы клеточного иммунного ответа.

Учитывая вышеизложенное, ученые предположили, что патогенетически оправдано включение в комплекс лечения аутоиммунного СД I препаратов, обладающих иммуносупрессивным действием [7, 8]. Спектр таких препаратов широк: циклофосфамид, азатиоприн и др. Таким препаратом, в частности, является метотрексат, широко применяемый при опухолевых и лимфопролиферативных процессах. Однако в очень низких дозах метотрексат обладает умеренным иммуносупрессивным действием [1, 4, 6].

Ряд ученых считают, что циклоспорин и метотрексат способствуют снижению активности аутоиммунного процесса при СД I и вызывают значительную ремиссию у больных, более того: в сочетании они демонстрируют синергизм в иммунодепрессивном действии. Однако есть некоторые различия. Tак, токсическое воздействие циклоспорина на организм значительно выше, чем метотрексата, что существенно ограничивает применение данного препарата в эндокринологии [3, 8]. По мнению Buckingham B.A. и Sandborg C. I. [4], применение метотрексата в дозе 5 мгв неделю приводит к стойкой ремиссии у больных СД I и снижению уровней специфических аутоантител класса ICA [3]. Кроме того, в работе [1] есть данные о том, что метотрексат в дозе 7,5 мг в неделю в течение 6–8 недель дал положительный эффект у больных аутоиммунным тиреоидитом Хашимото, что позволило достичь стойкой клинической ремиссии, положительной динамики и стабилизации лабораторных показателей.

Цель исследования – изучение эффективности иммуносупрессивного действия метотрексата при лечении больных СД I, влияние его на активность и тяжесть течения аутоиммунного процесса, а также на синтез воспалительных и противовоспалительных цитокинов.

Материалы и методы

Для оценки состояния клеточного звена иммунной системы у больных СД методом проточной цитометрии на аппарате FAXSCAN (BD) определяли основные клеточные популяции периферической крови (CD45+, CD3+, CD4+,CD8+, CD19+, CD16/56+). Для изучения функциональной активности Т-лимфоцитов, в частности эффекторных Th1-лимфоцитов, определялось содержание в сыворотке крови ряда провоспалительных цитокинов: IL-12 и IL-6, а также фактор некроза опухолей TNF наборами компании BIOSOURCE. Для анализа кровь из локтевой вены брали у больных утром натощак, центрифугировали, готовили сыворотку.

Обследованные больные с СД (80 человек) были разделены на две группы. Iа группа – 60 больных в возрасте от 5 до 34 лет с впервые обнаруженным СД I; Iв группа – 20 больных старше 29 лет, с диагнозом СД II менее 2 лет. Контрольную группу составили 20 практически здоровых человек в возрасте от 16 до 45 лет. Из 80 больных с сахарным диабетом было 45 (56%) пациенток женского пола. В контрольной группе было 10 женщин и 10 мужчин.

Пациенты принимали метотрексат 2,5 мг по 1 таблетке 3 раза в день 1 раз в неделю в течение 6 недель.

Результаты и обсуждение

У больных с СД I наблюдалась активация клеточных механизмов специфического иммунного ответа, по отношению к контрольным показателям было достоверно повышено количество общей популяции лимфоцитов, а также относительное и абсолютное содержание Т-лимфоцитов и Т-хелперов в периферической крови. В группе с СД II повышение Т-хелперов было умеренным. Однако обращал на себя внимание тот факт, что именно число Т-цитотоксических лимфоцитов (CD8+) было повышено в обеих наблюдаемых группах с сахарным диабетом, значительно превышая показатели контрольной группы. У больных c СД I было значительно повышено содержание В-лимфоцитов, а также абсолютное содержание NK-клеток. Результаты изучения цитокинов в этих группах, а также в контрольной группе приведены в табл. 1.

Таблица 1. Уровни провоспалительных цитокинов у больных с сахарным диабетом типов I и II

П р и м е ч а н и е:* – достоверное различие по сравнению с контрольной группой.

При сахарном диабете поражение ткани поджелудочной железы сопровождается развитием местного воспаления, что выражается усилением синтеза провоспалительных цитокинов и нарастанием их уровня в сыворотке крови. Именно цитокины, являясь биологически активными медиаторами воспаления, осуществляют кооперативное взаимодействие клеточных элементов как специфического, так и неспецифического иммунитета. Как видно из табл. 1, уровень провоспалительного цитокина IL-12 у больных с СД I достоверно повысился до 112,3±2,2 (р£0,001), но у больных 2-й группы синтез данного цитокина незначительно отличался от показателей контрольной группы (р£0,05). Данное положение подтверждает важную диагностическую роль цитокина IL-12 в дифференциации аутоиммунного сахарного диабета от СД II.

Еще большее значение имеет фактор некроза опухоли TNF-альфа, уровень которого значительно увеличен у больных с СД I (10,4±0,10 пг/мл) по сравнению с контролем (3,2±0,15 пг/мл). Отмечено, что уровень TNF-альфа увеличивается в более ранние сроки развития болезни по сравнению с другими изученными цитокинами. Полученные нами данные согласуется с мнением других ученых, которые отмечали, что подъем уровня TNF-альфа в сыворотке крови больных с СД характерен для ранней деструкции бета-клеток и выявляется в пике аутоиммунного процесса, происходящего в поджелудочной железе.

В отличие от приведенных выше данных, в группе больных с СД II на фоне повышения общего количества Т-лимфоцитов выявлено повышение так относительного, так и абсолютного содержания Т-супрессоров. Нами также установлено двукратное повышение уровней цитокина IL-6 и четырехкратное повышение TNF-альфа у этой категории больных. Так, уровень IL-6 достоверно повысился (до 7,92±0,65 пг/мл) по сравнению с контролем (3,3±0,05пг/мл) – в 2 раза. Такая же тенденция выявлялась и в отношении фактора некроза опухоли, уровень TNF-альфа ?у больных этой группы значительно повысился (до 13,2±1,2 пг/мл). Как известно, с возникновением воспалительных и сосудистых осложнений (ангиопатии, нефропатии, ретинопатии) происходит значительное повышение уровня TNF-альфа, который указывает на плохой прогноз и возможность развития осложнений. По результатам исследования можно предположить, что усиление синтеза провоспалительных цитокинов наблюдается у больных как с СД I, так и с СД II. Однако имеется ряд существенных отличий. Так, максимальное нарастание (в 2–3 раза по сравнению с контролем) IL-6, IL-12 и TNF-альфа отмечалось в основном у больных с первичным диабетом и давностью болезни менее 6 мес., тогда как при длительном заболевании с СД I или с СД II повышение уровней цитокинов было умеренным. Аналогичные результаты были получены Erbagci A.B. с соавт., которые обнаружили сходные изменения в содержании цитокинов у болеющих сахарным диабетом менее одного года.

При комплексном иммунологическом обследовании пациентов с СД I и СД II нами были выявлены определенные нарушения иммунного статуса. У больных с СД I наблюдается активация всех популяций клеточного иммунитета (Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-супрессоров, значительно повышено содержание В-лимфоцитов, а также абсолютное содержание NK-клеток). Отмечалось достоверное повышение уровней провоспалительных цитокинов IL-12 и TNF-альфа.

У больных с СД II наибольшие изменения касались Т-клеточного иммунитета (повышение общего количества Т-лимфоцитов, повышение относительного и абсолютного содержания Т-супрессоров), а также значительная активация синтеза цитокинов IL-6 и TNF-альфа.

Наблюдение за пациентами проводилось в течение всего периода иммуносупрессивной терапии, а также через 3 и 6 месяцев после отмены метотрексата, – побочного токсического эффекта у пациентов не отмечалось. В табл. 2 представлен уровень цитокинов до и после лечения метотрексатом.

Таблица 2. Уровень провоспалительных цитокинов до и после лечения метотрексатом

Как видно из табл. 2, у больных 1-й группы (метотрексат + базисная терапия) уровни всех изучаемых цитокинов снизились, причем содержание IL-12 и TNF-альфа снизилось почти в 3 раза. Наименьшее изменение претерпевало содержание IL- 6. Такая динамика содержания провоспалительных цитокинов у больных с СД I при использовании метотрексата потверждает его иммуносупрессивное действие на аутоиммунный механизм повреждения поджелудочной железы. Также наблюдается достоверное улучшение состояния больных в 1-й группе по сравнению со 2-й (базисная терапия).

Таким образом, показана обоснованность применения иммуносупрессивного препарата метотрексата при лечении аутоиммунного сахарного диабета. Назначение метотрексата в малых дозах (7,5 мг в неделю в течение 6 недель ) способствует достижению клинической и лабораторной ремиссии и не имеет токсических побочных воздействий.

Л и т е р а т у р а

1. Ахундова Д.К. Клинико-иммунологические аспекты диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы: автореф. …дис. канд. мед. наук. – Баку, 2008. – 20 с.

2. Дедов И.И., Петеркова В.А. Детская эндокринология. – М.: Медицина, 2006. – С. 482–498.

3. Abigail D., Scot G., McAfee A. // Psychiatr. Quarterly. – 2009. – Vol. 80, N 2. – P. 75–85.

4. Buckingham B.A., Sandborg C.I. // Clin. Immunol. – 2000. – Vol. 96, N 2. – P. 86–90.

5. Christopher M.K., Peter H.C., Jennifer M.B. // Endocrin. Metab. Disorders. – 2006. – Vol. 7, N 3. – P. 215–224.

6. Douglas O. Sobel, Annette Henzke, Val Abbassi // Acta Diabetologica. – Vol. 47, N 3. – P. 243–250.

7. Erbagci A.B., Tarakçioglu M., Coskun Y. et al. // Clin. Biochem. – 2001. – Vol. 34(8). – P. 645–650.

8. Gottlieb P.A., Hayward A.R. // Endocrinol. Metab. Clin. North. Am. – 2002  – Vol. 31(2). – P. 477–495.

9. Mammedhasanov R.M. Endokrinologiya. – Bak?, 2008. – S. 106–116.

Медицинскиеновости. – 2011. – №7. – С. 86-88.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.