Цель исследования — определить динамику показателей секреторного иммунитета по результатам исследования слюны часто и длительно болеющих школьников в ходе их комплексной реабилитации с включением фитопрепарата Тонзилгон®Н в условия детского реабилитационно-оздоровительного центра и определить целесообразность его использования в программе их реабилитации.

Материал и методы исследования

На базе Детского реабилитационно-оздоровительного центра «Ждановичи» наблюдали 42 часто и длительно болеющих ребенка школьного возраста. Критерии включения: школьный возраст, частота простудных заболеваний 4 и более раз в году. Дети проживали на загрязненных радионуклидами территориях. Все пациенты при поступлении на реабилитацию подвергнуты тщательному осмотру, проведен анализ сопроводительной медицинской документации. Комплекс базовой реабилитации включал стандартный набор воздействий (климато-, кинезо-, диетотерапия, физиотерапевтические методики и иглорефлексотерапия в зависимости от наличия показаний, психолого-педагогические мероприятия).

Случайным методом пациентов разделили на две клинических группы по 21 пациенту. В первую группу включили детей (средний возраст — 12,8±2,8 года, мальчиков — 10, девочек — 11), которые получали комплекс базовых реабилитационных мероприятий и Тонзилгон®Н в возрастной дозе в течение 10 дней. Во вторую клиническую группу отнесен 21 ребенок (средний возраст — 13,8±1,8 года, мальчиков — 8, девочек — 13), которые дополнительно к комплексу базовых мероприятий получали эхинацею в таблетках по 0,2 г в возрастной дозе в течение 10 дней.

Длительность реабилитации — 21 день. Исследование секреторного иммунитета выполняли в динамике: на 2-й день поступления в центр и за 1 день перед выпиской. На каждого ребенка заполняли специальную анкету.

Анализ секреторного иммунитета проводили по исследованию слюны. Слюну собирали утром натощак после предварительного трехкратного полоскания полости рта дистиллированной водой комнатной температуры. Образцы слюны замораживали и хранили при –20° С в морозильной камере. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) [1] в исследуемым образцах слюны с помощью ИФА тест-систем, изготовленных ЗАО «Вектор-Бест» (Россия, Новосибирск), определяли содержание 5 показателей местного гуморального иммунитета: секреторного иммуноглобулина А (IgAs), иммуноглобулинов (Ig) класса А, М, G, интерлейкина-4 (IL-4). Все исследования проводили согласно инструкции, прилагаемой производителем к каждому набору реагентов для ИФА определения концентрации названных 5 компонентов гуморального иммунитета.

Иммунологические исследования осуществлены в ЦНИЛ БелМАПО с детекцией результатов ИФА с помощью плашечного восьмиканального анализатора АИФ-340/М («Витязь», РБ), прошедшего метрологическую поверку и ПК. Применяли плашечный шейкер-инкубатор ELMI (Латвия) при различных режимах встряхивания и термостатитрования, а также автоматическое отмывающее устройство МВ-350 (Республика Беларусь) и центрифугу ОПН-3. Готовили рабочие растворы для дезобработки применяемой посуды, наконечников, дозаторов, приборов, опытных образцов. Для разведения концентратов использовали деионизированную воду.

Перед проведением ИФА образцы слюны размораживали, перемешивали, центрифугировали при 1500 об/мин. Для исследования отбирали надосадочную часть слюны, которую многоступенчато разводили согласно рекомендациям прилагаемой инструкции. Содержимое набора для определения отдельного показателя выдерживали при комнатной температуре 30 минут. Подготавливали аппаратуру к исследованию, одноканальные и многоканальные дозаторы различных объемов, планшеты, ванночки, одноразовые наконечники. Затем распаковывали набор и готовили рабочие разведения отмывающих буферов, растворы для разведения исследуемых проб, восстановления калибровочных и контрольных образцов, конъюгата. Предварительно размечали планшет на бумаге. Вскрывали фольгу и извлекали планшет с иммобилизованными на поверхности ячеек антителами для определения отдельного показателя. Заливали в ванночку разводящий буфер и вносили нужный объем в лунки для стандартов и контроля образцов слюны. После этого отбирали нужный объем калибраторов, контрольных и разведенных образцов и вносили в ячейки планшета. Заклеивали адгезивной пленкой поверхность планшета, который затем помещали в шейкер-инкубатор при 37°С без встряхивания или при 25°С, устанавливая режим встряхивания. Продолжительность инкубации следовала из инструкции к набору. Заливали отмывающий буфер в бутыль вошера МВ-350 и устанавливали режим отмывки (объем, отмачивание, количество стрипов и циклов).

После завершения инкубации планшет извлекали, пленку снимали и помещали в дезраствор. Далее планшет устанавливали в отмывающее устройство и 5 раз проводили отмывку. Перед завершением инкубации готовили рабочий раствор конъюгата согласно инструкции, его заливали в ванночку, хорошо перемешивая. Планшет после отмывки извлекали и, поместив его на рабочий стол, вносили конъюгат. Вновь закрывали адгезивной пленкой поверхность планшета и ставили в шейкер-инкубатор. После завершения этапа конъюгации проводили отмывку планшета очень тщательно — до 8 циклов. Непосредственно перед внесением в ячейки планшета готовили субстратную смесь, состоящую из концентрата тетраметилбензидина и субстратного буферного раствора, тщательно перемешивали в ванночке. Быстро вносили многоканальной пипеткой нужные объемы субстрата в ячейки планшета. Ставили в темное место для развития окраски при комнатной температуре на время согласно инструкции. Реакцию останавливали добавлением стоп реагента (раствором серной кислоты) в такой же последовательности, как и субстрат. Время между остановкой реакции и измерением составляло не более 5 минут. Планшет помещали в держатель 8-канального анализатора, который предварительно, в период первой инкубации, включали для прогрева, тестирования фильтров и установки режима готовности. Параллельно включали компьютер, проводили подготовку программы измерения, разметку планшета и условий измерения, сохраняли.

Затем измеряли оптическую плотность исследуемых проб, размещенных в планшете в двухволновом режиме (при основном фильтре — 450 нм и референс-фильтре — 620 нм). Строили калибровочный график, по которому рассчитывали концентрацию (мг/мл или пг/мл) исследуемых проб. Конечную концентрацию исследуемого показателя рассчитывали с учетом дополнительного разведения образцов слюны. Полученные результаты регистрировали в базе данных 5 показателей местного гуморального иммунитета, значения которых сопоставляли с клиническими данными с проведением комплексного анализа.

Динамическое наблюдение показало, что все дети хорошо переносили Тонзилгон®Н. Не отмечено аллергических и прочих нежалательных реакций на этот фитопрепарат.

Таким образом, можно сделать выводы, что:

1.       В процессе проведения комплексной реабилитации ЧБД школьного возраста с включением Тонзилгона®Н в условиях детского реабилитационно-оздоровительного центра удается достичь улучшения показателей секреторного иммунитета .

2.       В динамике в ходе комплексной реабилитации с включением Тонзилгона®Н наблюдается повышение концентрации в слюне IgА — одного из важных защитных факторов секреторного иммунитета слизистых.

3.       ЧБД школьного возраста хорошо переносят Тонзилгон®Н.

4.       Тонзилгон®Н может быть рекомендован для включения в программы реабилитации часто и длительно болеющих детей школьного возраста.

Литература 

1.        Василевский И.В. Реабилитация часто болеющих детей: учеб.-метод. пособие. — Минск: БелМАПО, 2006.

2.        Иммунологические методы / под ред. Т. Фримеля. — М.: Медицина, 1987. — С.162– 170.

3.        Лекарственные препараты в России: Видаль. — М.: АстраФармСервис, 2009. — С. Б-1277– Б-1278.

4.        Профилактика и лечение острых респираторных заболеваний у детей: пособие для врачей. — М.: Издательский дом «Династия».

5.        Реабилитация детей и подростков с заболеваниями органов дыхания, пищеварения, почек, сердечно-сосудистой системы и аллергическими болезнями в условиях поликлиники: учеб.-метод. пособие/ под общей редакцией В.Ф.Жерносека. — Минск: БелМАПО, 2007.

6.        Современные подходы к лечению и реабилитации часто и длительно болеющих детей: медицинская технология. — М.: Агентво медицинского маркетинга, 2006.

Статья предоставлена Представительством АО «BionoricaAGs» (ФРГ) в Республике Беларусь