Развитие лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) — грозная реальность современной эпидемио­логической ситуации по этому заболеванию [3, 12]. Первые сигналы о неблагополучии появились в конце 60-х годов. Тогда эта ус­тойчивость не превышала 3,5% и не вызы­вала большой тревоги [4, 5]. Через 15—20 лет более 20% выделяемых штаммов МБТ ока­зались устойчивыми к одному или несколь­ким противотуберкулезным препаратам [4, 6, 8, 12]. Усиление резистентности возбуди­теля туберкулеза требует разработки новых методических подходов к тестированию ле­карственной чувствительности МБТ.

Целью исследования была сравнитель­ная оценка тестирования лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза на средах Middlebrook 7H11, Левенштейна— Иенсена и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Исследование выполнено на 35 штаммах МБТ, выделенных от больных туберкуле­зом органов дыхания. Тестирование лекар­ственной чувствительности штаммов на сре­дах Левенштейна—Иенсена и Middlebrook 7Н11 проводилось методом абсолютных концентраций. Лекарственная чувствитель­ность определялась к изониазиду в концен­трации 1 мкг/мл, стрептомицину — 10 мкг/ мл, рифампицину — 20 мкг/мл, этамбутолу — 5 мкг/мл. Тестирование чувствитель­ности выделенных штаммов методом ПЦР к изониазиду проводилось с использовани­ем экспериментального набора посредством определения нуклеотидных последователь­ностей в генах kat G и inh А, тестирование чувствительности выделенных штаммов методом ПЦР к рифампицину — посред­ством определения нуклеотидных последо­вательностей в гене rро В.

Средняя продолжительность исследова­ния на агаровой среде составила 11,5 сут, на яичной среде — 21 сут, методом ПЦР — 1 сут. Совпадение результатов тестирования лекарственной чувствительности МБТ к изониазиду на среде Middlebrook 7H11 и среде Левенштейна—Иенсена было получено в 31 случае (88,6%), в 4 случаях (11,4%) определена лекарственная чувствительность к изо­ниазиду на среде Левенштейна—Иенсена у штаммов, резистентных к препарату на сре­де Middlebrook 7H11. Совпадение результа­тов тестирования лекарственной чувствительности МБТ к рифампицину на среде Middlebrook 7H11 и среде Левенштейна— Иенсена получено в 32 случаях (91,4%), в 3 случаях (8,6%) была определена лекарствен­ная чувствительность к рифампицину на сре­де Middlebrook 7H11 у штаммов, резистент­ных к препарату на среде Левенштейна— Иенсена. Совпадение результатов тестирова­ния лекарственной чувствительности МБТ к стрептомицину на среде Middlebrook 7H11 и среде Левенштейна—Иенсена получено в 30 случаях (88,2%), в 2 случаях (5,9%) опреде­лена лекарственная чувствительность к стреп­томицину на среде Левенштейна—Иенсена у штаммов, резистентных к препарату на среде Middlebrook 7H11. В 2 случаях (5,9%) определена лекарственная устойчивость к стрептомицину на среде Левенштейна—Иен­сена у штаммов, чувствительных к препара­ту на среде Middlebrook 7H11.

Совпадение результатов тестирования ле­карственной чувствительности МБТ к этамбутолу на среде Middlebrook 7H11 и среде Левенштейна—Иенсена получено в 26 слу­чаях (86,7%), в 4 случаях (13,3%) определе­на лекарственная резистентность к этамбутолу на среде Левенштейна—Иенсена у штаммов, чувствительных к препарату на среде Middlebrook 7H11.

Совпадение результатов тестирования ле­карственной чувствительности МБТ к изони­азиду на среде Middlebrook 7H11 и методом ПЦР было получено в 20 случаях (100%). Со­впадение результатов тестирования лекар­ственной чувствительности МБТ к рифампи­цину на среде Middlebrook 7H11 и методом ПЦР отмечено в 18 случаях (100%).

Совпадение результатов тестирования ле­карственной чувствительности МБТ к изо­ниазиду на среде Левенштейна—Иенсена и методом ПЦР получено в 19 случаях (100%). Совпадение результатов тестирования ле­карственной чувствительности МБТ к рифампицину на среде Левенштейна—Йенсена и методом ПЦР имело место в 17 случаях (94,4%). В одном случае (5,6%) методом ПЦР была установлена лекарственная чувствительность к рифампицину у штамма, резистентного к препарату при определении лекарственной чувствительности на среде Левенштейна—Йенсена. На среде Middlebrook 7H11 была опреде­лена лекарственная чувствительность этого штамма к рифампицину.

Говоря о методах определения лекарственной чувстви­тельности, следует обратить внимание на особенности роста микобактерий на различных типах питательных сред. При определении лекарственной чувствительности на среде Левенштейна—Йенсена результат учитывается че­рез 3 недели после посева по макроросту МБТ на повер­хности среды. Отметим, что во время свертывания яич­ной среды может уменьшаться содержание в ней неко­торых термолабильных препаратов, например стрепто­мицина. Среда Левенштейна—Йенсена принята ВОЗ в качестве международного стандарта для определения лекарственной чувствительности микобактерий. Унифи­кация определения лекарственной устойчивости МБТ позволяет получать результаты, сравнимые с таковыми при проведении эпидемиологических исследований. На плотных средах можно получить четко сравнимые ре­зультаты; массовые исследования лекарственной чувстви­тельности МБТ на плотных средах менее трудоемки, чем с использованием амплификационных методов, однако более продолжительны (по времени получения резуль­тата). Использование агаровых сред позволяет сократить сроки исследования в среднем на неделю.

В наших исследованиях совпадение результатов тес­тирования лекарственной чувствительности МБТ к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу на средах Левенштейна—Йенсена и Middlebrook 7H11 име­ло место в 88,2-91,4% случаев.

Необходимо иметь в виду, что создаваемые in vitro условия для тестирования лекарственной резистентнос­ти МБТ заведомо не могут воспроизводить естествен­ную среду обитания микобактерий, т.е. условия орга­низма человека. Поэтому результаты тестирования ле­карственной устойчивости in vitro с использованием любого метода не вполне адекватны лекарственной чув­ствительности, которую микобактерий проявляют в ес­тественных условиях. Как следствие, результаты тести­рования лекарственной устойчивости не всегда корре­лируют с эффективностью лечения больных.

Использование амплификационных методик для вы­явления различий в генетической структуре чувстви­тельных и устойчивых штаммов — новый подход к тес­тированию лекарственной резистентности микобакте­рий. Этот вид исследований стал возможен благодаря определению нуклеотидных последовательностей генов, мутации в которых приводят к формированию резис­тентности к рифампицину, изониазиду, стрептомици­ну, этамбутолу, фторхинолонам и этионамиду [1, 9-11, 13]. Мутации в амплифицированных генах обнару­живаются путем секвенирования или использования методик для обнаружения точковых мутаций. Недостат­ками ПЦР являются необходимость создания специ­альных условий для работы с ДНК и высокая стоимость оборудования и реагентов. Кроме того, ограничением для этого метода служит существование других меха­низмов резистентности. По данным литературы, при использовании амплификационных методик не обна­руживается около 10% случаев устойчивости к рифампицину, 20% — к изониазиду и 40% — к стрептомици­ну [7]. В нашей серии опытов результаты тестирования лекарственной чувствительности МБТ с использовани­ем метода ПЦР и среды Middlebrook 7H11 совпали в 100% случаев, с использованием метода ПЦР и среды Левенштейна—Йенсена — в 100% случаев для изониазида и в 94,4% случаев для рифампицина. Поэтому мо­лекулярные методы, вероятно, никогда не смогут пол­ностью заменить классические культуральные методы тестирования лекарственной устойчивости МБТ. Одна­ко использование амплификационных методов сокра­щает сроки исследования до нескольких часов. Это осо­бенно важно в нынешней ситуации, которая характе­ризуется высоким удельным весом лекарственно устой­чивых штаммов микобактерий [2].

Таким образом, использование комплекса новых и классических методических подходов к тестированию лекарственной чувствительности микобактерий тубер­кулеза позволяет оптимально быстро получить досто­верные результаты. Это открывает новые возможности для своевременной коррекции схем химиотерапии с целью достижения максимального клинического эф­фекта, предотвращения развития лекарственной резистентности возбудителя туберкулеза и снижения сто­имости лечения этого заболевания, что весьма акту­ально для Республики Беларусь.

Литература 

1.     Генерозов Э.В., Альтшулер М.Л., Говорун В.М. и др. // Пробл. туберкулеза. – 1999. – № 2. – С. 39–42.

2.     Корнеев А.А., Голышевская В.И., Севастьянова Э.В. и др. // Пробл. туберкулеза. – 1999. – № 2. – С. 44–47.

3.     Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. // Рефе­рат, сб. «Туберкулез». – М., 1999. – С. 1–6.

4.     Томан К. Туберкулез: выявление и химиотерапия. – Же­нева, 1979; М.: Медицина, 1980. – 137 с.

5.     Хоменко А.Г. // Пробл. туберкулеза. – 1996. – № 3. – С. 2–6.

6.     Хоменко А.Г., Голышевская В.И., Корнеев А.А. и др. // Рефе­рат, сб. «Туберкулез». – 1999. – № 1. – С. 1–6.

7.     Неут В., Honore N., Truffot–Pernot С. et al. // Lancet. – 1994. –V. 344. – P. 293–298.

8.     Ikeda Т., Tsurutani H., Hirose T. et al. // Kekkaku. – 1997. –V.72, N 1.–P. 9–13.

9.     Kwon H.H., Tomioka H., Saito H. // Tubercle & Lung Dis. –1995. _y. 76.–P. 141–148.

10.   Musser J.M. // Clin. Microbiol. Rev. – 1995. – V. 8. – P. 496–514.

11.   Nikaido H. // Science. – 1994. – V. 264. – P. 382–388.

12.   Rayshekhor V., Nalan C.M. // Tubercle & Lung Dis. – 1996. –V. 77, N 4. – P. 293–294.

13.   Telenti A. // Clin. Chest. Med. – 1997. – V. 18. – P. 55–64.

Медицинские новости. – 2000. – №11. – С. 60-61. 

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.