Особенностью современного течения урогенитальных инфекций является частая ассоциация возбудителей друг с другом. Длительное бессимптомное течение, множественные клинические проявления и отсутствие патогномоничных симптомов при микст-инфекциях значительно затрудняют диагностику этих заболеваний [1, 3]. В публикациях, посвященных вопросам диагностики урогенитальных инфекций, подчеркивается, что именно точная и своевременная диагностика — залог успешного и эффективного их лечения [2, 4].

Многообразие и несовершенство методов определения возбудителей создают предпосылки к получению недостаточно достоверных результатов, свидетельствуют о необходимости поиска новых возможностей лабораторной диагностики для детекции микст-инфекций [9, 11], в том числе урогенитального тракта.

Быстро и качественно обнаружить Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum возможно с помощью молекулярно-биологического метода — полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей выявлять ДНК возбудителя в биологическом материале [4, 7—9, 11]. Реакция основана на амплификации определенных последовательностей молекулы ДНК возбудителей путем повторных циклов высокотемпературной денатурации, отжига нуклеотидных праймеров и комплементарного достраивания цепи молекул ДНК [5]. Мультипраймерная ПЦР осуществляет синтез нескольких ДНК в одной реакционной среде с использованием нескольких пар праймеров, что позволяет проводить скрининг сразу по нескольким возбудителям инфекций и получить данные о сочетанных инфекциях с высокой достоверностью [6, 10].

Цель исследования — с помощью ПЦР разработать способ одновременного определения Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum и их ассоциаций в одной биологической пробе.

Основную группу составили 115 человек, в том числе 40 мужчин, страдающих хроническим уретритом неустановленной этиологии, и 75 женщин с эндоцервицитом. Длительность заболевания — от 3 мес до 7 лет. В контрольную группу вошли 50 практически здоровых лиц (25 женщин и 25 мужчин). Средний возраст обследуемых составил 30±5 лет. В качестве материала для исследования использовались соскобы эпителиальных клеток из уретры и цервикального канала, которые помещали в 100 мкл стерильного физиологического раствора. В каждом клиническом образце методом ПЦР определяли наличие ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum  с помощью диагностических наборов «Полимик» (НПФ «Литех»).

Весь технологический процесс исследования состоял из трех основных этапов: выделение ДНК из клинических образцов; амплификация фрагментов ДНК биологического возбудителя и детекция продукта амплификации электрофоретическим методом [4—6, 10].

При диагностике ассоциированных инфекций мы использовали возможность внесения сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одну реакционную пробирку для одновременной амплификации ДНК нескольких возбудителей, т.е. проведения мультипраймерной ПЦР-диагностики Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum.

При данном диагностическом подходе нуклеотидный состав праймеров был индивидуален: R1 (универсальный праймер), R2 (праймер для детекции Chlamydia trachomatis), R3 (праймер для детекции Ureaplasma urealуticum), 3ўR4 (праймер для детекции Mycoplasma hominis).

В пробирки типа «Eppendorf» объемом 0,5 мл вносили по 5 мкл анализируемого образца. В каждую из пробирок добавляли 20 мкл амплификационной смеси, состоящей из 11,9 мкл деионизированной воды, 7,5 мкл реакционной смеси (16,6 мМ (NH4)2SO4, 67мM Tris-HCl (pH 8,4), 2,5 мM MgCl2, 10 мМ 2-меркапто-этанол, по 2 мМ каждого dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), по 3 пмоль каждого из праймеров) и 0,6 мкл Taq-полимеразы.

Программа амплификации — единая для всех диагностируемых возбудителей, а именно:

I. Начальный этап +93°С.30 с.

II. Основной этап:

1. Расплетание двойной спирали ДНК (денатурация ДНК) +93°С.10 с.

2. Присоединение (отжиг) праймеров +60°С.10 с – 30 циклов.

3. Комплементарное достраивание цепей ДНК(синтез фрагмента ДНК) +72°С 10 с.

III. Заключительный этап +72°С..60 с.

Для оценки результатов использовали трансиллюминатор Н-2 («Петротерм», Россия) с длиной волны 310 нм с применением видеосистемы для регистрации гелей «Gel-Imager» («Петротерм») с помощью программы «Gel Explorer», версия 1,0 на базе компьютера «Intel Pentium-4».

На первом этапе анализ результатов проводился по контрольным образцам и внутренним контролям. Наличие в исследуемом образце возбудителя оценивалось по расстоянию пробега синтезированного фрагмента молекулы ДНК в пробе, причем если расстояние соответствует расстоянию пробега в пробе положительного контроля, то это свидетельствует о синтезе фрагмента ДНК возбудителя. Полоса, соответствующая по подвижности внутреннему контролю, указывала на законченную реакцию амплификации в пробах.

На втором этапе интерпретация результатов проводилась по размеру фрагмента молекулы ДНК, его молекулярной массе и интенсивности свечения (табл. 1, см. бумажную версию журнала).

Таблица 1. Молекулярные характеристики контрольных ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum (в относительных единицах (о.е.))

При анализе видовой специфичности воспалительных процессов урогенитального тракта у мужчин и женщин нами было установлено (табл.2 и 3), что наиболее часто обнаруживалась Ureaplasma urealуticum в сочетании с Chlamydia trachomatis — 25,7% всех положительных результатов. У женщин с эндоцервицитом это сочетание выявлено в 18 случаях (24%) положительных результатов, а у мужчин с хроническим неспецифическим уретритом — в 9 (22,5%).

Таблица 2. Результаты ПЦР-исследований у пациенток с эндоцервицитами (основная группа) и практически здоровых женщин

Таблица 3. Результаты ПЦР-исследований у пациентов с хроническим уретритом (основная группа) и практически здоровых мужчин

U.urealyticum в ассоциации с M.hominis была обнаружена у 8 (10,6%) обследованных пациенток гинекологического профиля и у 5 (12,5%) урологических больных.

Сочетание M.hominis и Ch.trachomatis отмечено у 8 пациенток, что составило 10,6% от числа обследованных женщин с воспалением шейки матки, и у 6 (15%) больных с воспалительным процессом в уретре.

Таким образом, ассоциации Ch.trachomatis в виде микст-инфекций выявлены у 41 пациента (35,6%), в том числе у 26 (34,6%) женщин и 15 (37,5%) мужчин. У 21 больного данный возбудитель был обнаружен в виде моноинфекции (12 (16%) женщин и 9 (22,5%) мужчин), что составляет 18,2% общего количества обследованных.

Основная доля в этиологии анализируемых нозологических форм заболеваний принадлежит U.urealyticum (59,1%). В виде ассоциированных инфекций U.urealyticum встречалась у 40 (34,7%) пациентов, в том числе у 26 (34,6%) женщин и 14 (31%) мужчин с инфекциями урогенитального тракта.

В контрольной группе практически здоровых женщин частота выявления этих микроорганизмов существенно отличалась: Ch.trachomatis и M.hominis не были обнаружены ни в виде моно-, ни в виде микст-инфекций, U.urealyticum встречалась как моноинфекция у 3 (12%) пациенток. В контрольной группе мужчин ДНК-позитивными в отношении U.urealyticum были 2 (8%) больных, и все пациенты оказались ДНК-негативными в отношении Ch. trachomatis и M. hominis.

У 8 (10,6%) пациенток гинекологического профиля и у 2 (5%) урологических больных при обследовании не выявлено ни одного из указанных возбудителей, что составило 9,5% общего количества положительных результатов.

Предложенный нами одномоментный метод определения возбудителей урогенитальных инфекций с помощью ПЦР позволяет быстро и достоверно идентифицировать наиболее значимые возбудители как моно-, так и микст-инфекций урогенитального тракта, при этом отсутствует необходимость проводить последовательные определения Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в биологической пробе у одного пациента. Метод способствует выявлению одновременно всего спектра возбудителей, их ассоциаций у одного пациента, сокращению расхода диагностических реагентов: агарозы, бромистого этидия, ТАЕ-буфера, расходного материала, а также времени проведения определения возбудителей в биологической пробе у одного больного.

При проведении массовых комплексных исследований ПЦР позволяет выявлять с высокой специфичностью и чувствительностью различные инфекционные агенты, перечень которых лимитируется лишь имеющимися в лаборатории праймерами.

Таким образом, предложенный нами метод детекции обеспечивает повышение чувствительности и двойной контроль качества, основанный не только на амплификации со специфическими праймерами, но и на оценке специфического фрагмента ДНК по размеру, интенсивности свечения и молекулярной массе.

Использование молекулярных характеристик фрагмента молекулы ДНК возбудителя в качестве критериев для идентификации результатов амплификации позволяет исключить субъективный подход в интерпретации этиологической специфичности воспалительного процесса урогенитального тракта.

1. Адаскевич В.П. Инфекции, передаваемые половым путем. — М.: Мед.книга, 1999. — 413 с.

2. Башмакова М.А., Бочкарев Е.Г., Говорун В.М. и др. Хламидиоз. Современные подходы к диагностике и лечению.— М., 2000. — 68 с.

3. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий. — СПб.: Ольга, 2000. — 573 с.

4. Костюк С.А., Хулуп Г.Я., Старченко С.М., Шевченко И.В. // Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении. — Мн., 2002. — С.220—224.

5. Лопухов Л.В., Эйдельштейн Н.В. // Клин. микробиология и антимикроб. химиотерапия. —2000. — Т.2, № 3. — С.96—106.

6. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. // Клин. лабор. диагностика. — 2000. — № 4. — С.25—33.

7. Bodo L.D. // Biotechnology. — 1993. — V.23. — P.235—241.

8. Crotchfelt K.A, Welsh L.E., DeBonville D. // Clin. Microbiol. — 1997. — V.35, N 11. — P.1536—1540.

9. Fredеricks D.N., Relmen D.A. // Clin. Infect. Dis. — 1999. — V.29, N 10. — P.457—488.

10. Hendolin P.H., Markkanen A., Ylikoski J., Wahlfors J.J. // Clin. Microbiol. — 1997. — V.35, N 12. — P.2854—2848.