Возможность включения чужеродных генов в хромосомы клеток млекопитающих. До изобретения техники рекомбинантной ДНК единственным источником большого количества чистого генетического материала были вирусы. В ранних исследованиях [10, 12] очищенную ДНК вируса SV 40 (simian virus) вначале вводили в бластоциты эмбриона мыши, а затем такие бластоциты реимплантировали в матку приемной матери, где они могли нормально развиваться. 40% родившихся мышат имели в некоторых своих клетках ДНК вируса SV 40. Животные были названы «мозаичными». Таким образом, оказалась возможной инкорпорация чужеродной молекулы ДНК в хромосомы клеток хозяина на самой ранней стадии развития эмбриона. Пораженные клетки «мозаичного» эмбриона были способны пролиферировать и дифференцироваться в ткани взрослого организма.

Сходный эксперимент с использованием вируса мышиного лейкоза Молони — HoMLV (holoney murine leucemia virus) показал, что провирус может интегрироваться в половые клетки и передаваться по наследству [13]. Если же вирус встраивался не в герминативные (половые), а в соматические клетки, наследственной передачи вируса не происходило.

Развитие техники клонирования генов позволило поставить более сложную задачу — получение трансгенных животных. Генетические исследования на низших организмах и клеточных культурах не давали ответа на вопрос, как влияют внутренние регуляторные факторы (гормоны, цитокины, ферменты, стромальные эффекторы) на организм млекопитающих.

В настоящее время создание трансгенных животных является своеобразной научной модой. Наибольшее число исследований проводится с мышами. В будущем не исключено широкомасштабное получение трансгенных сельскохозяйственных животных.

Самым успешным в плане воссоздания трансгенных животных оказался метод введения клонированного гена в мышиные эмбрионы на самых ранних стадиях их развития (до стадии образования синкариона) — в недавно оплодотворенные яйцеклетки, когда они еще содержат два пронуклеуса: один мужской (из спермы), другой женский (принадлежащий самой яйцеклетке) [9].

Общая схема реализации этого метода такова [3]:

1)         клонирование полезного гена — трансгена, который намечено включить в организм выбранного животного;

2)         микроинъецирование трансгена (т.е. введение нескольких сотен копий чужеродной ДНК в 2 пл раствора) в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Мужской пронуклеус больше, чем женский, и является лучшей мишенью для микроинъекции;

3)         имплантация яйцеклетки, содержащей чужеродный трансген, в фаллопиеву трубу «приемной» матери — ложнобеременной самки, покрытой стерильным самцом (рис. 1).

После скрещивания самки с самцом оплодотворенные яйцеклетки собирают путем их вымывания из фаллопиевых труб яичника. В мужской пронуклеус инъецируют 2 пл раствора, содержащего несколько сотен копий чужеродной ДНК. Инъецированные яйцеклетки затем переносят в матку приемной матери.

Процент яйцеклеток, которые выживают при манипуляции и начинают развиваться, варьирует, но, как правило, не превышает 10—30%. Из уцелевших яйцеклеток чужеродную ДНК, интегрированную в их хромосомы, содержат 0—40% [8]. Введенная ДНК интегрируется случайно, беспорядочно, без какого-либо предпочтения хромосомной локализации, обычно в виде тандемного множества копий в одном локусе хромосомы.

Родившееся потомство в возрасте 3 недель проверяется на присутствие трансгена методом саузерн—блоттинга ДНК (Southern blotting), экстрагированной из кусочка хвоста мышонка. Для этого молекулу ДНК вначале разрезают на отдельные фрагменты ферментом рестриктазой. Затем их разделяют методом гель-электрофореза. После проведения электрофореза делается нитроцеллюлозная репликация электрофореграммы [17]. Нитроцеллюлозосвязанную ДНК инкубируют с 32Р-зондовой ДНК, т.е. молекулой ДНК, нуклеотидная последовательность которой известна (либо после проведения электрофореза фрагменты ДНК переносят на нейлоновую сеточку и опускают мембрану в раствор меченной 32Р-молекулы ДНК) [3]. Зонд связывает только те фрагменты молекулы ДНК-мишени, последовательность пар оснований которых сходна с молекулой-зондом. Это «спаривание» называется гибридизацией. Как правило, для локализации связанного зонда используется ауторадиография, с помощью которой выявляют ДНК, комплементарную к 32Р-зонду. Гибридизация ДНК с ДНК и называется Southern blotting.

Мыши, имеющие чужеродный ген, называются трансгенными, а чужеродная ДНК — трансгеном.

Возможность стабильной интеграции чужеродной ДНК в герминативные клетки. Установлено, что ДНК, введенная в одноклеточный эмбрион, может стабильно включаться в хромосомы соматических или герминативных клеток [7]. Если такому эмбриону мыши инъецировать клонированный ген интерферона человека, то родившиеся животные могут передать своим потомкам этот трансген как свой собственный, согласно закону распределения признаков различных генераций «цветного горошка Менделя» [4].

Мыши, получившие стабильный трансген, становятся основателями новой линии мышей-носителей трансгена, поэтому они и называются мышами-основателями. Заметим, что мыши-основатели имеют только единичную копию трансгена на хромосоме, т.е. они гетерозиготные относительно трансгена. Если скрестить двух мышей-основателей, то 25% потомков дадут две копии трансгена и будут гомозиготными, 25% будут нулевыми копиями, а остальные 50% дадут одну копию. Если далее скрещивать гомозиготных трансгенных животных, то все их потомство будет иметь две копии трансгена [3].

Прямое введение ДНК в пронуклеусы оплодотворенных мышиных яйцеклеток является эффективным средством получения трансгенных животных, но не дает возможность манипулировать интеграцией ДНК и контролировать ее.

Стволовые клетки эмбриона могут включать чужеродный трансген. После установления факта, что чужеродные гены, введенные в эмбрион, присутствуют в стабильно интегрированной форме в соматических и герминативных клетках взрослой мыши [12, 15], необходимо было выяснить, каким образом регулируется экспрессия генов. Перспективным подходом к решению этого вопроса была идея использовать эмбриональные стволовые клетки [7,14]. Если ввести трансгенную ДНК в эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), а затем перенести трансфецированные клетки в развивающийся эмбрион, то окажется, что ЭСК инкорпорируются в эмбрион (рис.2) [17].

Эта выдающаяся способность ЭСК может считаться эквивалентом модели с пронуклеусами мыши (рис.1). При инъекции в мышиные бластоциты ЭСК способны участвовать в образовании всех тканей [5]. ДНК может быть введена в ЭСК путем трансфекции, ретровирусной инфекции или другим способом.

ЭСК получают с помощью культивирования мышиных бластоцитов, растущих в клеточной культуре подобно всем другим клеткам. Однако обязательным является создание условий, препятствующих дифференцировке ЭСК. Это достигается одним из следующих способов: 1) выращиванием клеток на питающем монослое фибробластов; 2) добавлением в культуральную среду ингибирующего фактора, например лейкиния. В таких условиях ЭСК могут расти в течение многих недель и при этом сохранять способность к дифференцировке [7]. Дифференцировка возможна в направлении образования миокарда [1], сосудов, хряща, миобластов и нервных клеток (рис.2) [3].

Бластоциты изолируют через 3 дня после скрещивания мышей и помещают в культуральную среду. Размножаясь, они распространяются по поверхности чашки Петри. Скопления клеток, образующие внутреннюю клеточную массу и формирующие будущий эмбрион, изымают и разобщают на отдельные клетки с помощью протеолитического фермента трипсина. Если ЭСК культивировать без питающего подслоя фибробластов, они будут дифференцироваться в различные ткани. При культивировании на питающем подслое фибробластов они будут продолжать размножаться, но не дифференцироваться. Если ЭСК инъецировать в бластоциты, они станут образовывать внутреннюю клеточную массу и формировать ткани химерной мыши. Вклад стволовых клеток в химерное потомство легко оценить по цвету шерсти, если реципиентные бластоциты были взяты от мышей с шерстью разного цвета.

По данным работы [1], в культурах ЭСК, дифференцирующихся в кардиомиоцитарном направлении, всегда будет присутствовать часть клеток, дифференцирующихся в стромальные клеточные типы, назначение которых, по-видимому, состоит в поддержании условий существования пула дифференцированных клеток.

Важнейшим преимуществом генетического переноса в организм животного является то, что клетки, несущие трансген, могут быть подвергнуты селекции перед тем, как их инъецируют в бластоцит [5, 15].

ЭСК можно вводить с помощью ретровирусного вектора или плазмид, несущих neo-ген [18]. Neo-ген определяет устойчивость к антибиотику неомицину, т.е. в питательной среде с неомицином могут расти только ЭСК, содержащие neo-ген. Если неомицинрезистентные клетки ввести в мышиные бластоциты, то потомство, полученное в результате этого эксперимента, будет иметь не только neo-ген, интегрированный в их геном (это легко установить с помощью саузерн-блоттинга), но и инъецированную чужеродную ДНК [15]. Так как in vitro с ЭСК, перед тем как сделать инъекцию в эмбрион, можно всячески манипулировать, открываются большие возможности для воссоздания мышей с мутацией в строго определенном гене, а также реальная перспектива замены мутантного гена на нормальный.

Трансгены могут отвечать на регуляторные воздействия. Хотя трансген включается в хромосому в место, отличное от его эндогенной локализации в клетках хозяина (где он не является трансгеном), он тем не менее достаточно часто экспрессируется, подобно аналогичному нормальному гену. С целью определения типа экспрессии проводится анализ различных тканей на присутствие соответствующей мРНК или белка, кодируемого этим геном. Видовые различия могут быть выявлены при анализе трансгенного продукта, отличного от его эндогенного партнера. Например, мРНК, транскрибирующую ген инсулина человека, можно легко отличить от мРНК, ответственной за транскрипцию гена инсулина мыши [16]. При этом транскрипция человеческого трансгена инсулина может индуцироваться теми же сигналами, которые отвечают и за индукцию собственных генов инсулина мыши.

Таким образом, чужеродный трансген может не только экспрессироваться в соответствующей ткани, но и регулироваться теми же сигналами, что и эндогенные гены. Сходные результаты были получены при использовании многих генов, внедренных в трансгенных мышей с помощью ЭСК-трансфера [6, 11].

Использование такой уникальной модели, как трансгенные животные, значительно расширяет наши представления о механизмах эмбрионального развития и его дефектах, а также чрезвычайно перспективно в поиске путей решения проблемы рака.

Литература 

1.         Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенников М.Е. и др.// Эксперим. биология. — 2003. — № 4. — С. 461 — 465.

2.         Beddington R.S.P., Robertson E.J. // Development. — 1989. — V. 105. — P. 733 — 737.

3.         Clark D.P., Russel L.D. // Mol. Biology. — Cache River Press, 2000. — P. 225 — 226.

4.         Constantini J.W., Lacy E. // Nature. — 1981. — V. 294. — P. 92 — 94.

5.         Cossler A., Doetschman T., Korn E. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1986. — V. 83. — P. 9065 — 9069.

6.         Edwards R.Н., Rutter W.j., Hanahan D. // Cell. — 1989. — V. 58. — P. 161—170.

7.         Evans M.J., Kaufman M.H. // Nature. — 1981. — V. 292. — P. 154 — 156.

8.         Gordon J.W., Scangos G.A., Plotkin D.J. et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1980. — V. 77. — P. 7380 — 7384.

9.         Gordon J.W., Ruddle F.H. // Science. — 1981. — V. 214. — P. 1244 — 1246.

10.       Gordon J.W. // Intl. Rev. Cytol. — 1989. — V. 115. — P. 171—229.

11.       Hanahan D. // Nature. — 1985. — V. 315. — P. 115—122.

12.       Jaenisch R., Mintz B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1974. — V. 71. — P.1250 — 1254.

13.       Jaenisch R. // Science. — 1989. — V. 240. — P. 1468 — 1474.

14.       Martin C.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1981. — V. 78. — P. 7634 — 7636.

15.       Robertson E.A., Bradley M.k., Evans M. // Nature. — 1986. — V. 323. — P. 445 — 448.

16.       Swift G.H., Hammer R.E., MacDonald R.J., Brinster R.L. // Cell. — 1984. — V. 38. — P. 639—646.

17.       Voet D., Voet L.G. // Biochemistry. — New York: John Wiley, 1995.— P. 872.

18.       Watson J., Gilmann M. Recombinant DNA. — New York: Freeman and Comp., 2001.— 446 p.