Несмотря на успехи, достигнутые в лечении злокачественных новообразований, проблема формирования химио- и радиорезистентности, а также перекрестной устойчивости патологических клеток к терапевтическим факторам является одной из важнейших как для онкологии в целом, так и для онкогематологии в частности. Современный уровень знаний о механизмах развития противоопухолевых эффектов свидетельствует о многосторонности и внутренней противоречивости проблемы чувствительности и устойчивости опухолевых клеток к терапии.

 Известно, что индукция первичных изменений, вызывающих резистентность опухолей к повреждающим воздействиям, происходит как на молекулярном, так и на клеточном уровне: взаимодействие с мишенями, блокирование отдельных внутри-клеточных процессов, нарушение контроля клеточного цикла, апоптоза [3] не исключает участие в последующем изменений на более высоких уровнях организации живой материи (межклеточные взаимодействия, ткань, системы органов, организм) [11]. Устойчивость опухоли – сложный феномен, в основе которого лежит ряд молекулярных изменений, причем в одной и той же клетке функционируют одновременно несколько механизмов, модулирующих чувствительность опухолевых клеток к лечению.

Специфические и типовые молекулярные процессы, которые определяют ответ клетки на стресс, в том числе на токсическое или радиационное воздействие, связаны с широким диапазоном реакций – от ограничения накопления химиопрепарата внутри клетки до отмены программы гибели клетки, индуцируемой повреждающим воздействием [27]. Вероятность включения в клетке нескольких защитных механизмов не исключает ведущей роли одного определенного механизма. Кроме того, в некоторых случаях клетки неоплазий еще в процессе опухолевой трансформации до начала терапии обнаруживают резистентность к применяемым воздействиям (первичная, долечебная резистентность). Она может быть связана с тканеспецифическим характером экспрессии и активностью некоторых белков, определяющих резистентность клеток к ксенобиотикам. Вторичная (приобретенная) резистентность возникает в клетках, подвергшихся стрессовым воздействиям, в том числе в результате применения лечебных средств. Устойчивость формируется на разных «ступенях» воздействия на клетку, причем на каждой «ступени» задействованы различные молекулы [31, 119].

Селективное преимущество опухолевым клеткам обеспечивает не только устойчивость, индуцированная повреждающим фактором, но и другие свойства, такие как ускоренное размножение, изменение чувствительности к факторам роста. Эти факторы влияют на селекцию клеток как лекарственными препаратами, так и другими воздействиями [9]. При этом адаптационные изменения, обеспечивающие выживаемость клеток за счет временной активации их защитных механизмов, лежат в основе устойчивости к терапии части опухолевых клеток. Эти изменения и их связь с развивающейся впоследствии стабильной резистентностью опухолей изучены мало [24].

Изучение фармакокинетики и фармакодинамики, химической структуры и механизма действия лекарственных средств, а также биологических свойств самой опухолевой клетки позволяет приблизиться к пониманию причин развития резистентности опухолевых клеток к химиотерапии [91, 22, 110]. В настоящее время насчитывается более 100 различных по природе, химическому строению, механизму действия и фармакологическим характеристикам препаратов, предложенных для лечения опухолей [1, 3]. Наиболее распространенная классификация противоопухолевых препаратов, основанная на их химической структуре, происхождении и механизме действия, включает следующие классы соединений: алкилирующие агенты, образующие ковалентные связи с ДНК (цисплатин, карбоплатин, допан, циклофосфан и др.); антиметаболиты, избирательно блокирующие метаболические пути (метотрексат, флударабин, гидроксимочевина и др.); противоопухолевые антибиотики и близкие к ним препараты, проявляющие как противоопухолевую, так и антибактериальную активность (рубомицин, доксорубицин, блеомицин и др.); препараты растительного происхождения (винкристин, таксотер, этопозид и др.); ферменты (L–аспарагиназа); гормональные препараты (дексаметазон, преднизолон и др.); модификаторы биологических реакций (цитокины, интерфероны и др.) [9, 118].

В основе феномена лекарственной устойчивости лежат различные по природе внутриклеточные механизмы, детерминированные на генетическом и эпигенетическом уровнях [7, 10, 19, 27, 47, 71, 81]. Основными составляющими лекарственной устойчивости являются: 1) изменение транспорта препарата через плазматическую мембрану, что приводит к уменьшению аккумуляции цитостатика в клетке; 2) повышенная активность детоксицирующих систем глутатиона и металлотионеина; 3) повышенная репарация ДНК; 4) нарушение уровня экспрессии тимидилатсинтетазных ферментов; 5) нарушение уровня экспрессии онкогенов; 6) повреждение систем сигнальной трансдукции.

Транспортные системы и их роль в лекарственной резистентности. Первым этапом на пути реализации цитотоксического эффекта противоопухолевых препаратов является взаимодействие цитостатика с плазматической мембраной. Изменение строения мембраны, а также прямого и обратного транспорта через нее — одна из основных составляющих лекарственной устойчивости [105, 159]. В мембранах опухолевых клеток, устойчивых к действию цитостатиков, содержится холестерола, гликосфинголипидов, сфингомиелина и фосфолипазы D больше, чем в мембранах чувствительных клеток. На поверхности устойчивых к химиотерапевтическому воздействию опухолевых клеток наблюдается гиперэкспрессия АТФ-зависимых помповых белков, которые принимают участие в выведении цитостатиков из клетки. Такая резистентность, обусловленная гиперэкспрессией и высокой функциональной активностью этих белков, и является собственно МЛУ, поскольку ее развитие к одному препарату природного происхождения (например, к алкалоидам, антрациклинам, таксанам и др.) делает опухолевые клетки устойчивыми к ряду других противоопухолевых средств [86, 112]. МЛУ связывают с транскрипционной активацией и повышением функциональной активности клеточных АТФ-зависимых кассетных ABC (ATP Binding Cassette) транспортных белков [45, 119]. К ним относятся протеины, кодируемые генами Mdr1 (Multidrug Resistance), Mrp (Multidrug Resistance-associated Protein), Tap (Transcription Associated Protein). К белкам МЛУ причисляют также LRP (Lung Resistance Protein), относящийся к семейству “сводчатых” протеинов [16, 107]. К суперсемейству ABC транспортеров принадлежит и другой транспортный белок – BCRP (Breast Cancer Resistant Protein).

Значительный интерес представляет ген Mdr1, продуктом которого является трансмембранный белок Р-gp/ABCB1 (P – проницаемость) с молекулярной массой 170 кД. Этот белок использует энергию АТФ для удаления из клетки чужеродных молекул, в том числе гидрофобных противоопухолевых соединений, которые свободно диффундируют через плазматическую мембрану внутрь клетки [15, 129]. P-gp 170 способен активироваться при большинстве лимфопролиферативных заболеваний, в частности при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ), а также при бластном кризе ХМЛ [153, 21]. P-gp 170 вносит свой вклад в резистентность больных к химиопрепаратам природного происхождения, включая таксаны, антрациклины, алкалоиды vinca, подофиллотоксины, камптотецины [6], и даже к лекарственным иммуноконъюгатам [148]. Повышенный уровень экспрессии Р-gр чаще всего отмечается в клетках опухолей, которые развиваются из органов и тканей, непосредственно контактирующих с ксенобиотиками (желудок, легкие), что, по-видимому, и может быть одной из причин низкой эффективности химиотерапии больных с такой локализацией злокачественного процесса [2]. Этот феномен объясняется особенностями процессов трансформации нормальной ткани в опухолевую, когда при утрате или нарушениях специфических функций нормальной клетки экспрессия Р-gр часто сохраняется. Именно этот факт может быть основной причиной формирования первичной лекарственной резистентности [19].

До настоящего времени считается, что Р-gp непосредственно связывается с цитостатиками и имеет в составе трансмембранного домена специальный сайт связывания. Однако в последние годы модель Р-gp-помпы утрачивает популярность. Предложена новая модель действия Р-gp, согласно которой он не транспортирует цитостатики в клетку непосредственно, а влияет на изменение транспорта ионов и путей передачи сигналов, что важно для регуляции ключевых биофизических параметров клетки (таких, как рН внутриклеточных компартментов и мембранный потенциал). Эти параметры далее определяют диффузию цитостатиков через цитоплазматическую мембрану, а также активность сигнальных путей, связанных с реализацией апоптотического эффекта препарата [19, 74, 119]. Действительно, в клетках с MDR1 фенотипом наблюдается повышение внутриклеточного уровня рН, что сопровождается подавлением доксорубицин-зависимого апоптоза и что, вероятно, обусловлено не снижением концентрации препарата, а его инактивацией. Предполагается, что в условиях защелачивания подавляется активность и других цитостатиков [114]. Так, клетки больных ХМЛ, экспрессирующие ген Mdr1, менее чувствительны к α-интерферону – препарату, который не выкачивается из клетки [19].

Гиперэкспрессия белка MRP1/ABCC1 обусловливает развитие устойчивости к препаратам типа доксорубицина, винкристина, этопозида и колхицина. MRP принимает участие в формировании МЛУ при хроническом лимфобластном лейкозе (ХЛЛ) и промиелоцитарном лейкозе. Природным субстратом для MRP являются лейкотриен С4 и глутатион [2, 89]. Повышенная экспрессия белков MRP увеличивает АТФ-зависимый транспорт глутатион-8-конъюгатов ксенобиотиков и цитостатиков. MRP экспрессируется в большей мере на внутриклеточных мембранах и осуществляет компартментализацию противоопухолевых препаратов, которые далее выводятся из клетки путем экзоцитоза. Часто именно экспрессия MRP является неблагоприятным признаком для прогноза течения опухолевого процесса [2, 16, 54].

В литературе имеются сведения как о высокой корреляции между экспрессией P-gp 170 и других белков МЛУ, так и об отсутствии таковой. В частности, экспрессия P-gp и MRP в клетках сублинии рака желудка, устойчивой к цитостатику ванкомицину, оказалась в 8 и 6 раз более высокой, чем в клетках исходной линии [42]. В других работах показано, что таксаны — не совсем подходящий субстрат для MRP, ввиду чего клетки аденосаркомы поджелудочной железы, устойчивые к таксотеру, экспрессировали высокий уровень P-gp 170 при незначительном уровне MRP [83, 88].

Белок LRP является членом семейства рибо- и нуклеобелков, которые локализуются в цитоплазматических везикулах и ядерных мембранах, и его функция связана с перераспределением ксенобиотиков (в частности, доксорубицина) из ядра в цитоплазматические везикулы [16]. Клинические исследования с использованием моноклональных антител, специфичных к этому белку, показали, что его повышенная экспрессия у больных при раке яичника и остром миелобластном лейкозе (ОМЛ) является индикатором слабого ответа на химиотерапию и плохой выживаемости больных. Экспрессия LRP часто появляется у пациентов, опухолевые клетки которых вначале были Р-gр положительными, а затем утратили экспрессию Р-гликопротеина. Наличие этого феномена можно объяснить, с одной стороны, компенсаторной экспрессией LRP, а с другой – селекцией P-gp-отрицательных клеток.

Таким образом, изменение состава клеточных мембран и степени активности транспортных систем, благодаря которым внутриклеточная концентрация препарата поддерживается на низком уровне, является важной составляющей в механизме формирования лекарственной устойчивости [2]. Однако при анализе этого явления следует иметь в виду данные, указывающие на неоднозначность такой корреляции. Так, клетки гепатоцеллюлярной карциномы, несмотря на свою устойчивость к химиопрепаратам, имеют низкий уровень экспрессии LRP [145]. Известны различного рода взаимодействия между белками МЛУ в лейкозных клетках, ведущие к повышению экспрессии одних белков и снижению экспрессии других. Тем не менее, один из механизмов формирования резистентности к винкристину и таксотеру в лимфобластоидных линиях связан с такими белками МЛУ, как P-gp 170, MRP, и в меньшей степени с LRP [8, 135].

Важную роль в формировании МЛУ может играть и BSRP/ABCG2, при этом его экспрессия и функциональная активность часто коррелируют с уровнем P-gp [127]. Так, высокий уровень отмечен в клеточных линиях рака легкого, устойчивых к митоксантрону, доксорубицину, адриамицину, даунорубицину [77], но не в опухолевых клеточных линиях, устойчивых к винкристину и таксотеру [8, 136]. Как и другие белки МЛУ, BCRP обнаруживается не только в химиорезистентных клеточных линиях различного тканевого происхождения, но и в нормальных, немалигнизированных клетках органов (почки, печень). BCRP не детектируется в таких клетках, как лейкоциты, эритроциты, тромбоциты [25]. Не обнаружен высокий уровень функциональной активности этого белка в клетках при рецидивах и плохо поддающихся лечению ОМЛ [134, 146]. Вполне вероятно, что для резистентных опухолевых клеток кроветворного происхождения BCRP, изначальный уровень которого в клетках может быть низок, в меньшей степени участвует в формировании МЛУ, нежели P-gp, что наблюдается в лимфобластоидных сублиниях IM 9/Vcr и IM 9/Tax [8].

Как уже упоминалось выше, все белки МЛУ являются нормальными компонентами клеток, функция которых связана с детоксикацией и выводом ксенобиотиков, и в числе прочих в варьирующих количествах экспрессируются в лейкоцитах [19]. Тканевая экспрессия P-gp включает практически все клетки лимфоцитарного происхождения, MRP в норме экспрессируется в макрофагах и Т-лимфоцитах, LRP – в макрофагах [139]. Таким образом, формирование МЛУ как результат экспрессии ABC кассетных протеинов — наиболее распространенный механизм МЛУ в силу того, что это крайний вариант нормального механизма адаптации к неблагоприятным факторам внешней среды [11]. В то же время механизмы, участвующие в формировании генетической нестабильности при опухолевой прогрессии, способствуют также усилению функциональной активности протеинов МЛУ в клетках опухоли, так как выраженность их экспрессии значительно превосходит таковую в соответствующих нормальных клетках при терапии цитостатиками [86].

Выброс химиопрепарата из клетки, опосредованный высокой функциональной активностью P-gp, по-видимому, является одним из универсальных для разных химиопрепаратов механизмов устойчивости опухолей к терапии [6]. Известно, что опухоли сами по себе уже имеют высокий уровень функциональной активности белка P-gp 170. Многократно подтверждено, что резистентные опухолевые клетки способны выкачивать препараты посредством высокой активности трансмембранной помпы P-gp 170. Так, MDR положительные химиорезистентные клетки линии гепатоцеллюлярной карциномы и линии мышиных фибробластов NIH 3T3, а также резистентные к доксорубицину клетки K562/Dox характеризовались более высоким выбросом флуоресцентного красителя родамина 123, который используется в качестве индикатора активности этой функции, чем клетки родительских линий [52, 126]. Суперинвазивные опухолевые клетки обладают обычно устойчивостью к различным индукторам и повышенной экспрессией и активностью данного белка [60, 73, 149]. Высокую активность P-gp 170 в резистентных клетках, в том числе лимфобластоидных, подтверждает возможность понижения ее до уровня обычных клеток путем добавления специфических ингибиторов этого белка, таких как верапамил и циклоспорин [50, 108, 136, 137, 141], что позволяет использовать этот феномен для повышения чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам [13, 56, 92, 116, 136].

Исходя из предполагаемой основной роли P-gp 170 в становлении МЛУ во многих случаях можно было бы ожидать, что сублинии с модифицированной, т.е. подавляемой циклоспорином, функцией P-gp в процессе становления резистентности окажутся чувствительными к химиопрепаратам-индукторам резистентности. Однако в экспериментальных условиях сублинии IM 9/Vcr/Cs и IM 9/Tax/Cs оказались более резистентными соответственно к винкристину и таксотеру по сравнению с родительской линией IM 9, хотя их резистентность была несколько ниже в сравнении с сублиниями IM 9/Vcr и IM 9/Tax, устойчивость которых к индукторам формировалась без ингибиции P-gp, что указывает на возможность частичного замещения функции P-gp другими механизмами [135].

Подтверждением этого положения служат данные, полученные на других моделях и свидетельствующие о функционировании нескольких различных механизмов в резистентных опухолевых клетках. Так, линия рака легкого MCF–7, устойчивая к доксорубицину, проявила высокую экспрессию не только белка P-gp 170, но и антиапоптотического Bcl-2 [44]. Клетки линии, устойчивой к ксенобиотику мышьяку, обладали высоким уровнем активности детоксицирующей системы глутатиона при значительной экспрессии генов Mrp1/Mrp2 и Mdr1 [89]. Важно, что для работы семейства белков MRP необходимы не только АТФ, но и глутатион [16]. Не исключено, что при обнаружении повышенной функциональной активности или экспрессии MRP в клетках химиорезистентных сублиний на основании косвенных данных можно предполагать, что и детоксицирующие системы участвуют в формировании фенотипа МЛУ этих сублиний.

Экспериментальные результаты, свидетельствуя о наличии у полученных сублиний МЛУ к ряду исследованных препаратов, согласуются с данными литературы о формировании перекрестной химиорезистентности [48, 97, 143], например к винкаалкалоидам, таксанам и антрациклинам [7, 48, 51, 135, 142]. Однако, с точки зрения преодоления в клинических условиях лекарственной нечувствительности, существенное значение имеет отсутствие у резистентных сублиний тотальной лекарственной резистентности ко всем исследуемым цитостатикам. Для некоторых препаратов наблюдается обратный эффект – повышение чувствительности. Так, лейкозные клеточные линии К562 и HL60, резистентные к доксорубицину и винкристину, что отмечено и для сублинии IM 9/Vcr, оказались более чувствительными к акридиновым цитостатикам — аналогам пиримидиновых оснований [7, 29]. Более того, действие одних препаратов может даже усиливать цитотоксический эффект других. В частности, клетки лимфолейкоза P388, устойчивые к таксотеру и винкристину – цитостатикам, являющимся субстратом для белков МЛУ, стали более чувствительными к этим препаратам после воздействия авермектинов – группы паразитоцидных веществ, обладающих апоптотической противоопухолевой активностью [79]. При этом чувствительность исследуемых клеток к цисплатину не изменилась. Указывается также на повышение чувствительности химиорезистентных клеток к алкилирующим препаратам и антиметаболитам, которые не являются субстратами белков ABC суперсемейства и обладают механизмами действия, не подверженными влиянию мембранных помп [36]. С другой стороны, сублинии, резистентные к этопозиду, таксотеру или винкристину, также оказались чувствительными к цисплатину, флударабелу и лейкладину, являющимся соответственно алкилирующим агентом и антиметаболитами [7, 8, 10, 62, 135, 136]. Из факта обнаружения повышенной чувствительности резистентных опухолевых клеток к отдельным лекарственным препаратам следует возможность подбора такого сочетания нескольких цитостатиков, которое будет способствовать созданию оптимальной схемы химиотерапии в случае возможного формирования устойчивости опухоли к какому-либо из препаратов. Например, при возникновении устойчивости к таксотеру перспективным является применение пуриновых аналогов (в частности, лейкладина и флударабела), а также цисплатина, но не винкристина. При наличии устойчивости клеток к винкристину эффективными могут быть лейкладин и цисплатин, но не таксотер и этопозид.

Топоизомеразы и их роль в противоопухолевой резистентности. Топоизомеразы –ферменты, которые уменьшают напряженность спиралей ДНК и играют важную роль в транскрипции, репликации и рекомбинации. Эти ферменты временно соединяются с ДНК и образуют ее одно- или двунитевые разрывы, раскручивают спираль ДНК и затем снова ее сшивают. В клетках млекопитающих различают два вида топоизомераз. Ферменты I типа с молекулярной массой 110 кД разрезают и раскручивают одноцепочечную нить ДНК, что дает возможность двум участкам ДНК по обе стороны от разрыва свободно вращаться друг относительно друга. Топоизомеразы II типа существуют в двух формах: с молекулярной массой 170 кД (топоизомераза II-α) и 180 кД (топоизомераза II-β). Топоизомеразы II типа связываются с обеими цепями двойной спирали ДНК и вносят в нее на время двухцепочечный разрыв. Ферменты этого типа активируются под действием тех участков на хромосомах, где перекрестились спирали. Присоединившись к такому перекресту, топо-изомераза обратимо разрывает одну из двух двойных спиралей, «вынуждает» вторую двойную спираль пройти через этот разрыв и сшивает обе разорванные цепи, а затем отделяется от ДНК. Уровень активности топоизомераз повышается с ростом клетки при прохождении G1 или S и G2–M фаз клеточного цикла. Фосфорилирование топоизомераз происходит в течение всего клеточного цикла [2]. Предполагают, что устойчивость опухолевых клеток к ингибиторам топоизомераз может быть обусловлена, с одной стороны, уменьшением экспрессии и снижением активности этих энзимов, а с другой – мутациями в специфических доменах топоизомераз. При этом определяется четкая корреляция между усилением экспрессии гена Mdr1 и снижением активности топоизомеразы II типа в опухолевой ткани [66, 105].

Внутриклеточные системы детоксикации глутатиона и металлотионеина. Активность системы глутатиона и металлотионеина крайне важна в защите клетки от воздействия различных токсических факторов, включая цитостатики. Изменения уровня глутатиона и ферментов его метаболизма являются основой для уменьшения активности ряда цитостатиков путем их внутриклеточной детоксикации [2, 156]. Глутатион – наиболее распространенный небелковый тиол, присутствующий в клетках млекопитающих, и связанные с его метаболизмом энзимы являются важнейшими компонентами резистентности клеток к алкилирующим агентам, в том числе к соединениям платины [125]. Большинство клеточных линий, устойчивых к цисплатину, отличаются повышенным содержанием внутриклеточного глутатиона и (или) гиперактивностью фермента, инициирующего синтез глутатиона, — γ-глутамилцистеинсинтетазы [125]. Заслуживает внимания ингибитор синтеза глутатиона – бутионин сульфоксимин (BSO). В резистентных клеточных линиях после обработки их BSO отсутствует чувствительность к действию цисплатина. Однако такая обработка клеток линий рака желудка человека MKN-28 и MKN-45, рака яичников КК и МН, аденокарциномы ротовой полости KB приводила к увеличению их чувствительности к действию цисплатина [19]. Важно отметить, что изменения в функционировании глутатионовой системы не могут полностью объяснить устойчивость к лечению цитотоксическими препаратами у онкологических больных. Более того, вклад данной системы в формирование МЛУ значительно меньше, чем вклад белков суперсемейства АВС [128].

Особая роль в формировании резистентности отводится металлотионеинам. В свободном состоянии металлотионеин является нуклеофильным соединением и связывает электрофильные противоопухолевые препараты типа цисплатина, а также мелфалан и некоторые антибиотики: адриамицин, блеомицин [2]. Клетки, гиперэкспрессирующие металлотионеин, часто резистентны к действию цисплатина и таксотера [133]. Опыты по трансфекции гена металлотионеина также показали, что клетки-трансфекты приобретают резистентность к цисплатину, хлорамбуцилу и мелфалану. Однако экспрессия металлотионеина — не обязательное условие резистентности к цисплатину, так как встречаются резистентные к этому лекарственному препарату клеточные линии, в которых металлотионеин не выявляется [2].

Репарация ДНК-аддуктов как феномен формирования лекарственной резистентности. Многие химиопрепараты проявляют свой цитостатический эффект путем образования внутрицепочечных сшивок ДНК. Внутрицепочечные сшивки образуются из предшественников монофункциональных ДНК-аддуктов. Эти сшивки приводят к гибели клеток, если они своевременно не подвергаются репарации или элиминации. Устойчивость к цитостатикам коррелирует с экспрессией в опухолевых клетках энзима репарации ДНК – метилгуанин-метилтрансферазы, которая удаляет алкильные аддукты в 6-й позиции гуанина до того, как происходит формирование сшивки, тем самым предотвращая цитотоксический эффект препарата [95]. Одним из механизмов устойчивости клеток к противоопухолевым препаратам с подобным механизмом действия является ускоренная репарация ДНК-аддуктов. Исходно гиперчувствительные к действию цисплатина клеточные линии отличаются пониженной способностью ликвидировать основные аддукты ДНК и цисплатина (GG-Ptu GA-Pt), а также ослабленной активностью ДНК-полимераз [93]. Обработка резистентных к цисплатину клеток афидиколином – ингибитором α и β ДНК-полимераз – восстанавливает их чувствительность к цисплатину и тем самым подтверждает значение репарации аддуктов цисплатин-ДНК в формировании лекарственной устойчивости [2, 19].

Лекарственная резистентность и ключевые белки клеточного цикла и апоптоза. Цитотоксическое действие большинства противоопухолевых препаратов, независимо от конкретного механизма их действия, реализуется путем индукции апоптоза. Эффект осуществляется посредством дерегуляции генов, участвующих в промотировании или ингибировании апоптотической программы при воздействии. Наиболее изучен вклад в формирование лекарственной резистентности протоонкогенов с-Myc, Ras и Src, сверхэкспрессии генов семейства Bcl-2 и нарушения функциональной активности онкосупрессора P53 [38]. Вопрос о связи лекарственной устойчивости со статусом P53 в опухолевых клетках рассматривают с двух взаимно противоположных позиций: 1) экспрессия Р53 дикого типа (wt P53) повышает чувствительность к химиотерапии, поскольку ускоряет вхождение клеток в апоптоз; 2) белок wt P53 снижает чувствительность клеток к действию цитостатиков путем остановки клеточного цикла для репарации ДНК.

Мутантный белок P53, в отличие от нормального, не обладает способностью останавливать клетки с поврежденной ДНК в G1-фазе, и они начинают репликацию ДНК на поврежденной матрице, что ведет к нестабильности генома и повышает вероятность их злокачественной трансформации. Клетки, в которых дикий тип P53 отсутствует, резистентны практически ко всем формам индукции апоптоза [19]. Потеря нормальной функции P53 обусловливает устойчивость к алкилирующим агентам и ингибиторам топоизомеразы II типа [18]. Продемонстрирована положительная корреляция между частотой мутаций в гене P53, уровнем лекарственной устойчивости и плохим прогнозом при хронических лимфопролиферативных заболеваниях (ХЛПЗ) [103]. Ген опухолевого супрессора P53 является критическим компонентом сигнального каскада клеточного цикла, который вызывает после повреждения ДНК блокирование клеточного цикла в фазе G1 либо G2 [15]. Потеря функции P53 в процессе развития опухолей может привести к не соответствующему пролиферации выживанию клеток с поврежденной ДНК [19].

Известно, что белки семейства Bcl играют важную роль в регуляции процесса апоптоза, индуцированного различными физиологическими и химиотерапевтическими стимулами. Действие Bcl-2 основывается на контроле высвобождения депонированного внутриклеточного кальция, главным образом из эндоплазматического ретикулума и митохондриального пула. Продукты генов семейства bcl-2 вызывают ингибирующий эффект при запуске апоптоза как физиологическими (Fas, ФНО-α), так и лекарственными триггерами (этопозид, антиметаболиты, алкилирующие агенты). Некоторые из Bcl белков (Bcl-xL, Bag и Bcl-2) препятствуют развитию апоптоза, тогда как другие (Bcl-xS, Вах, Bad, Bak и Bid), наоборот, являются промоторами этого процесса [2]. Гиперэкспрессия белков Bcl-2 и Bcl-xL наблюдается при многих неопластических заболеваниях человека. Причем такая гиперэкспрессия ассоциирована с резистентностью опухолевых клеток к действию противоопухолевых препаратов [5]. Повышенная экспрессия Bcl-2 при некоторых видах лимфом, лейкозов, нейробластоме, раке простаты и яичника является маркером устойчивости опухолевых клеток к химиотерапии. Однако при раке легкого и молочной железы наблюдается обратная картина: повышенная экспрессия Bcl-2 — показатель хорошей чувствительности к химиотерапии [2].

Увеличение экспрессии антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL может происходить в клетке параллельно с уменьшением экспрессии проапоптотического белка Вах. Поскольку Вах способен образовывать гетеродимеры с Bcl-2, соотношение этих белков в клетке и определяет предрасположенность последних к апоптозу, индуцируемому цитостатиками, в большей мере, чем просто уровень экспрессии Bcl-2. При изучении трансфекции гена Bах на устойчивых к лекарственной терапии клетках in vivo и in vitro показано, что увеличение экспрессии белка Вах в клетках-мишенях значительно увеличивает чувствительность последних к действию цитостатиков [2, 3, 19].

Работы, выполненные на резистентных к действию цисплатина клеточных линиях, продемонстрировали роль онкогена Fos в нечувствительности к этому препарату. В устойчивых линиях клеток наблюдался повышенный уровень экспрессии гена Fos. Существуют и другие гены, которые активируются после действия цитостатика и определяют уровень чувствительности клетки [2, 3]. Гиперэкспрессия супрессорного гена Nт23 сопровождается, как правило, ростом чувствительности к цисплатину [61] и приводит к формированию в клетках большего числа межцепочечных сшивок ДНК. Ген Mdr1 может непосредственно влиять на ряд каспаз, тем самым участвуя в апоптозе. Так, в клетках, экспрессирующих P-gp, выявлено не только снижение продукции активной формы каспазы 3, но и резкое подавление ее протеолитической активности – способности расщеплять ядерный белок поли-(АДФ-рибоза)-полимеразу, участвующий в репарации поврежденной ДНК. [47]. Известно, что P-gp является АТФ-азой [15] и что АТФ — необходимый фактор активации каспазы 9. Снижение внутриклеточного пула АТФ препятствовало активации каспазы 9 и гибели клетки [47]. Возможно, P-gp также подавляет апоптоз, снижая уровень внутриклеточного АТФ.

Стромальный фактор резистентности. Известно, что данные о чувствительности клеток к лекарственным препаратам, полученные in vitro в суспензионных культурах, не всегда коррелируют с особенностями течения и результатами лечения заболеваний кроветворной ткани. Такие расхождения связаны с тем, что условия in vitro не отражают весь комплекс факторов, влияющих на устойчивость клеток к терапии in vivo. В организме клетки опухоли взаимодействуют с ростовыми и антиапоптотическими факторами, продуцируемыми микроокружением органов, в частности клетками стромы костного мозга [14, 62]. Совокупность механизмов избегания апоптоза при контакте опухолевых клеток с клетками стромы обозначается как стромальный фактор резистентности (СФР). Протективный эффект СФР распространяется на такие апоптотические стимулы, как терапия химиопрепаратами и глюкокортикоидами [58, 105], обеднение среды ростовыми факторами, что проявляется благодаря поражению клеток стромы при химио- и лучевой терапии, а также как результат интенсивной локальной пролиферации клеток опухоли. Механизмы, приводящие к повышенному выживанию опухолевых клеток, например при В-клеточных ХЛПЗ в совместных культурах со стромальными клетками, включают повышенную аутокринную и паракринную продукцию цитокинов и усиление активности внутриклеточных антиапоптотических медиаторов, таких как протеины семейства Bcl-2, при непосредственной адгезии на белки экстраклеточного матрикса [123]. Кроме того, выживание опухолевых клеток может быть связано и с изменением проапоптотической активности продукта мутантного гена P53. В этом отношении исключительный интерес представляют доказательства существования принципиально нового класса резистентности, не присущей самим лимфоидным опухолевым клеткам, а проявляющейся только при условии их взаимодействия с компонентами гемопоэтического микроокружения [37, 82].

Адгезионные взаимодействия с элементами экстраклеточного матрикса (ЭКМ), с одной стороны, инициируют каскад цитокиновых регуляторных взаимодействий, а с другой — сами стимулируют внутриклеточный перенос сигнала, способного ингибировать сигнал программированной клеточной гибели, в том числе лекарственно- и радиационно-индуцированный [41]. Адгезия клеток В-ХЛПЗ на стромальный монослой приводит к усилению секреции GM CSF, TNF–α и -β, TGF–β, IL–3, IL–1, IL–6, HGF [64]. Дальнейшие цепи переноса сигнала включают регуляцию адгезионных взаимодействий через интегрины семейств β1 и β2 [41], модуляцию продукции белков ЭКМ и активацию клеток эндотелия стромы [113], что в конечном итоге приводит к избеганию апоптотической гибели и селективному выживанию клеток В-ХЛПЗ. Из цитокиновых взаимодействий при контакте клеток миеломы со стромой костного мозга придают значение стимуляции экскреции интерлейкина-6, который наряду с регуляцией пролиферации осуществляет функцию экстраклеточного супрессора апоптоза при действии как физиологических, так и лекарственных стимулов.

Основным неклеточным элементом ЭКМ в костном мозге является фибронектин (ФН). Адгезия на лунки, покрытые ФН, может приводить к проявлению дополнительной резистентности к цитостатикам, усиливая фенотип МЛУ [41]. Это явление получило название адгезионно опосредованной лекарственной устойчивости. Один из центральных переносчиков внутриклеточного протективного сигнала в клетках нелимфоидных тканей — киназа фокальной адгезии pp125FAK [62].

Растворимые факторы, продуцируемые стромой, и адгезионные взаимодействия (прямой контакт с клетками стромы) существенно влияют на жизнеспособность опухолевых клеток [14, 62, 37, 41, 63]. По-видимому, различные интегрины принимают активное участие в формировании резистентности клеток на строме к повреждающим воздействиям [64, 99, 123, 159]. Так, миеломная клеточная линия RPMI 8226 при контакте со стромой оказалась более устойчивой к апоптотическому действию доксорубицина и мелфалана, чем до контакта. При этом повышалась экспрессия клетками ряда интегринов (VLA-4 и VLA-5) и фибронектина [41].

Репарация повреждений ДНК. Известно, что действие ионизирующих лучей вызывает одно- и двуцепочечные разрывы ДНК. Репарация двойных разрывов, в основе которой лежит гомологичная рекомбинация, является одним из важнейших факторов поддержания целостности генома и жизнеспособности клетки. Группу генов, таких как Rad50-57, Mre11 и Xrs2, отвечающих за восстановление поврежденной ДНК, относят к Rad52 семейству [183, 158]. Их продукты являются посредниками в инициации рекомбинации, а также непосредственно способствуют АТФ-зависимому формированию гомологичных пар и внутрицепочечных обменов. Так, Rad52 трансфицированные клетки млекопитающих оказались почти в 2 раза более устойчивыми к ионизирующей радиации, чем клетки исходных родительских линий, при этом у трансфектов наблюдалась высокая степень гомологичной рекомбинации [147]. Следовательно, Rad52, участвующий в репарации двойных разрывов ДНК, способен принимать участие также в процессе формирования радиорезистентности.

Роль репарации повреждений ДНК в формировании радиорезистентности показана на примере человеческой эндонуклеазы Ape1/ref-1, выполняющей репарационную функцию. При этом Ape1/ref-1 является мультифункциональным белком, участвующим в регуляции клеточного цикла, транскрипции, трансдукции сигнала. Установлено, что резистентные к цитостатику блеомицину и γ-облучению опухолевые клетки рака яичка обладают высоким уровнем экспрессии Ape1/ref-1. Трансфицированные клетки эмбриональной карциномы со встроенным вектором, содержащим множественную последовательность генов, кодирующих Ape1/ref-1, также обладали повышенной устойчивостью к повреждающим агентам. Очевидно, повышенная активность эндонуклеазы обеспечивает более эффективную репарацию повреждений ДНК и, следовательно, более высокую жизнеспособность клеток. При этом исследуемые клетки были менее чувствительны к блеомицину, нежели к γ-излучению. Указанный факт объясняется комплексным воздействием радиации на клетки, в то время как основное действие блеомицина основано на возникновении однонитевых разрывов ДНК, которые Ape1/ref-1 успешно устраняет [113].

В возможном формировании устойчивости к радиации участвует фосфатидилинозитол-зависимая протеинкиназа АТМ – продукт гена, отвечающего за атаксию-телеангиэктазию и локализованного в хромосоме 11q22-23. АТМ в качестве посредника участвует в процессах активации репарации ДНК в ответ на ее повреждение и в регуляции клеточного цикла. Клетки с недостатком или отсутствием АТМ являются дефектными в отношении обусловленной ионизирующей радиацией индукцией гена р53 и, соответственно, обладают измененной радиочувствительностью. С использованием дефектных по АТМ клеток показано, что С-терминальный домен АТМ участвует в поддержании хромосомной стабильности, задержке клеточного цикла в S-фазе в ответ на облучение и обеспечивает нормальную чувствительность к ионизирующей радиации. Два других структурно связанных с АТМ протеина – АТМ-связанный протеин (ATR) и ДНК-зависимая протеинкиназа (DNA-PK) — также участвуют в детекции и трансдукции сигнала от поврежденной ДНК и в контроле клеточного цикла. В частности, при трансфекции в клетки радиочувствительной мышиной линии СНО xrs-6, дефектной по репарации радиационно-индуцированных двойных разрывов ДНК, гена Ku-80, кодирующего одну из регуляторных субъединиц DNA-PK, наблюдается активация DNA-PК, что ведет к снижению радиочувствительности [115].

На связь радиочувствительности не только с изменениями самого P53, но и с нарушением других компонентов апоптотического сигнального пути указывает следующий факт. Клетки меланомы, несмотря на наличие нормального немутантного P53, являются высокорадиорезистентными. Однако этот протеин не способен вызывать задержку клеточного цикла или участвовать в запуске процесса апоптоза в ответ на радиационное повреждение ДНК вследствие мутаций генов, кодирующих киназу АТМ и Chk2/Hcds1, отвечающих за стабилизацию и активацию P53 в ответ на воздействие и, следовательно, за передачу апоптотического сигнала [120]. Chk1 и Chk2 — основные эффекторные киназы в ответ на радиационное повреждение ДНК. В частности, Chk2 посредством фосфорилирования участвует в транскрипционной активации P53 после повреждения ДНК, являясь своеобразным опухолевым супрессором. Мыши с дефектом гена, кодирующего упомянутую киназу, более устойчивы к облучению, чем мыши контрольной родительской линии [70]. Таким образом, дефект активации P53 в ответ на повреждение ДНК обусловливает появление устойчивости к ионизирующей радиации. При изучении роли гистонов в процессе формирования устойчивости установлено, что гистон Н2АХ в ответ на повреждения ДНК, возникающие в результате облучения, фосфорилируется и привлекает в область поврежденного хроматина определенные ДНК-связывающие белки, что, в свою очередь, инициирует репарацию поврежденных фрагментов [131].

Устойчивость к ряду повреждающих факторов различной природы, в частности к ионизирующему облучению, связывают с работой так называемой MMR (mismatch repair) репарации ДНК. MMR репарация участвует в исправлении ошибок при ДНК репликации, играя важную роль в сохранении генома. Этот тип репарации также выполняет редактирующую функцию в процессе рекомбинации. Ошибки MMR репарации часто встречаются при различных опухолевых заболеваниях [84, 96, 154]. В репарации задействованы семь основных белков: hMLH1, hMLH3, hPMS1, hPMS2, hMSH2, hMSH3 и hMSH6, главными из которых являются hMSH2 и hMLH1 [76, 129]. Механизм функционирования этой системы заключается в узнавании и связывании нестабильных участков ДНК, содержащих ошибки репликации, комплексом hMutSα (состоит из белкового гетеродимера hMSH2/hMSH6), что предшествует внедрению комплекса hMutLα, состоящего из белкового гетеродимера hMLH1/hPMS2. За присоединением комплексов следует вырезание участка, содержащего ошибки. Неправильная последовательность замещается верной копией, а процесс сшивания завершает репарацию [101].

Согласно одному из предположений о роли корректирующей репарации ДНК в формировании радиорезистентности опухолей, при повреждающем воздействии ионизирующей радиации на ДНК возникают множественные нарушения нуклеотидов, в результате чего система MMR при невозможности исправления ошибок запускает апоптотический каскад, что ведет к гибели клетки. Однако при неэффективности системы опухолевые клетки, несмотря на генетические нарушения, способны выживать и, тем самым, оказаться устойчивыми к повреждающему фактору. Таким образом, предполагается роль MMR системы как основного детектора повреждений ДНК. Высказывается мнение о том, что способность hMutSα и hMutLα взаимодействовать с поврежденными основаниями является одним из компонентов системы контроля за запуском апоптоза [76].

Регуляция апоптоза. Цитостатическое действие лучевой терапии, как и противоопухолевых препаратов, реализуется путем индукции апоптоза. Поэтому развитие резистентности к обоим типам противоопухолевой терапии так или иначе связано с факторами, влияющими на апоптоз [4, 17]. Воздействие ионизирующей радиации вызывает мутацию генов-супрессоров опухолей, активацию онкогенов, тем самым нарушая индукцию апоптоза в опухолевых клетках и способствуя развитию радиорезистентности [115]. Механизмы, по которым клетка «чувствует» радиационное повреждение ДНК, еще недостаточно хорошо изучены. Установлено, что данный процесс связан с белком P53, а также с некоторыми протеинкиназами (c-Abl, ATM). В результате по-вреждения происходит активация P53, что ведет к различным биохимическим ответам клетки на воздействие: апоптоз или выживание (репарация). Апоптоз происходит по пути активации Bax – ингибитора антиапоптотического фактора Bcl-2 и IGF -BP3 – ингибитора инсулинового ростового фактора-1 (IGF–1), который активирует антиапоптотический сигнал. Выживание клетки осуществляется посредством задержки клеточного цикла и репарации ДНК с участием P21^WAF1/CIP1 и Gadd45 [24, 40].

Контрольные точки клеточного цикла. Ионизирующая радиация инициирует остановку клеточного цикла или его задержку в G1, S и G2 фазах. Механизмы, которые позволяют клетке отвечать на повреждения ДНК задержкой клеточного цикла, благодаря чему осуществляется репарация повреждений и тем самым их ограничение, и есть контрольные точки клеточного цикла, которые во многом определяют клеточный ответ на действие повреждающих агентов, прежде всего таких, как ионизирующее излучение и химиопрепараты. Например, мутации P53 в культивируемых клетках лимфомы Беркитта приводят к потере возможности задержки клеточного цикла в поздней G1-фазе, что в норме регулируется P53 зависимым ингибитором G1-циклинзависимой киназы P21^WAF1/CIP1. Эти клетки становятся в 2–3 раза более резистентными к радиации, что объясняется в основном потерей способности мутантного P53 индуцировать апоптоз [40]. С другой стороны, потеря G2 контрольной точки в клетках лимфомы и карциномы обусловливает повышение их чувствительности к цитотоксическому действию радиации и цитостатиков. Последующее быстрое включение в митоз клеток с повреждениями ДНК ведет к дальнейшим хромосомным нарушениям и клеточной гибели. И наоборот, блок в G2-фазе клеточного цикла способствует повышению радиорезистентности в опухолевых клетках [115]. Так, in vitro клеточная линия цервикальной карциномы человека HeLa более устойчива к γ-облучению, чем линия меланомы MoWo. При этом только у HeLa наблюдался блок в G2-фазе клеточного цикла и аккумуляция циклинов В1 и Cdc2, регулирующих G2-фазу цикла. Этот эффект связывают не с мутацией гена P53, который в норме способен вызывать задержку в G1-фазе, а с дефектом P53-опосредованного сигнального пути [140]. В других исследованиях показано, что временная гиперэкспрессия Bcr-Abl киназы ведет к повышению резистентности к апоптозу и снижению радиочувствительности в лимфомных клетках. Bcr-abl — онкогенная форма гена c-Abl, появляющаяся при транслокации 9;22 в филадельфийской хромосоме при ХМЛ. Продукт этого гена — нуклеарная тирозинкиназа — участвует в активации P53 вследствие повреждения ДНК. Радиопротективное действие Bcr-Abl проявляется через пролонгированный блок в G2-фазе клеточного цикла [115].

Как уже отмечалось, резистентность к апоптозу является одной из ключевых составляющих химио- и радиорезистентности опухолей. Ген P53 индуцирует апоптоз как посредством регуляции транскрипции генов, кодирующих апоптоз регуляторные белки, так и без нее. Возможно, наиболее важные из этих механизмов — экспрессия гена, кодирующего проапоптотический белок Bax, и угнетение экспрессии гена, ответственного за продукцию антиапоптотических белков группы Bcl-2. Показано, что мутантные белки P53 не способны участвовать в активации Bax, при этом приблизительно 50% опухолей человека имеют мутации P53 [115, 140]. Так, одним из проапоптотических продуктов семейства Bcl-2 является белок P21^BAX, который в норме совместно с P21^WAF1 участвует в задержке клеточного цикла в G1-фазе при воздействии радиации. Многие опухоли различного происхождения имеют мутации, которые ведут к нарушению способности P53 участвовать в индукции апоптоза посредством активации P21^BAX. Показано, что клеточная линия глиобластомы значительно менее чувствительна к ионизирующему излучению, чем клетки медуллобластомной линии. В более радиорезистентных клетках глиобластомы преобладал мутантный P53 и, как следствие, наблюдалась низкая активация проапоптотического промотора P21^BAX [124]. Кроме того, многие опухоли с нормальным P53 имеют мутации самого гена Bax [115].

Активация онкогенов. Активация онкогенов, помимо связи с клеточной трансформацией, может оказаться причиной изменения радиочувствительности. Например, экспрессия P21ras, мутации Fhit и P16 опосредованно ведут к повышению клеточной радиорезистентности, что может быть связано с запуском антиапоптотического сигнального пути. Так, в эмбриональных фибробластах крыс активация h-Ras онкогена в кооперации с геном папилломавируса человека 16-e7 и мутантным P53 ведет к возникновению фенотипа клеточной радиорезистентности [115].

Среди генов, контролирующих апоптоз клеток, имеется протоонкоген Bcl-2, выполняющий противоположную гену P53 дикого типа функцию в регуляции апоптоза. Имеются данные, что резистентность некоторых опухолей к ионизирующему излучению обусловлена повышенной экспрессией гена Bcl-2, блокирующего апоптоз [39]. Протоонкоген c-Myc кодирует фактор транскрипции, который участвует в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и трансформации. При определенных условиях (например, отсутствие ростовых факторов) экспрессия c-Myc может индуцировать апоптоз [115]. Myc онкоген может инициировать неспособность клеток к задержке клеточного цикла в G2-фазе под воздействием ионизирующего излучения, тем самым снижая их выживаемость [140]. Показано, что трансфектные h-Ras онкогеном крысиные эмбриональные фибробласты обладают более низкой чувствительностью к ионизирующей радиации. С другой стороны, те же клетки, трансфицированные v-Myc онкогеном, не отличались изменением радиочувствительности. Однако комбинация v-Myc и h-Ras ведет к синергетическому эффекту усиления радиорезистентности клеток. Таким образом, v-Myc — потенциальный генетический модификатор радиочувствительности [115].

К другим онкогенам, участвующим в регуляции клеточного ответа на действие ионизирующего излучения, относят Raf-1, продуктом которого является серин-треониновая киназа, участвующая в трансдукции Ras сигнала; Bcr-abl; v-Mos – онкогенная копия c-Mos, продуктом которой является другая серин-треониновая киназа, участвующая в трансдукции сигнала, который способствует активации MAPK (митоген-активированные протеинкиназы). Несмотря на то что активация онкогенов ведет в основном к усилению радиорезистентности, имеются данные о существовании некоторых онкогенов, которые повышают чувствительность к облучению. Данный феномен можно объяснить модуляцией эффекта онкогенов экспрессией апоптоз-регулирующих протеинов, таких как P53 и Bcl-2 [39, 115].

Роль цитокинов и ростовых факторов. Различные ростовые факторы и цитокины способны подавлять апоптоз, что ведет к повышению жизнеспособности клеток и снижению радиочувствительности. Наиболее хорошо изучен так называемый фактор выживаемости IGF–1. Активированные IGF рецепторы участвуют в трансдукции антиапоптотического сигнала [115]. В сигнальный путь вовлекается Akt (протеинкиназа B) – продукт v-Act онкогена, который является одним из наиболее значимых медиаторов клеточной резистентности к различным повреждающим воздействиям. Akt, в свою очередь, опосредованно активирует Ras-сигнал, что ведет к ингибированию c-Myc-индуцированного апоптоза. Этот антиапоптотический сигнальный путь является основным. Поскольку Akt участвует в антиапоптотическом сигнальном пути, интересным фактом было выявление белка-посредника, который указывает на роль Akt в клеточной выживаемости. С этой целью исследовали несколько потенциальных белков, которые могли быть связаны с IGF–сигнальным механизмом и тем самым участвовать в химио- и радиорезистентности. К примеру, с-Akt фосфорилирует белок Bad, который относится к Bcl-2 семейству апоптотических регуляторов. Bad протеин, находясь на митохондриальной мембране, связывается с Bcl-xL, что ведет к потере митохондриями цитохрома С, который в норме совместно с Apaf-1 приводит к активации каспазы 9, участвующей в клеточной гибели [30].

Интерлейкин-1 (IL-1) как мультифункциональный медиатор биологического иммунного ответа на повреждения и инфекцию посредством активации рецепторов I типа к IL–1 может блокировать или усиливать апоптоз в нормальных и опухолевых клетках. Оба ответа зависят от типа клеток и окружающих условий и, частично, от состояния гипоксии. Показано, что введение IL-1, фактора некроза опухолей (TNF) или фактора стволовых клеток (SCF) мышам приводит к радиопротекторному эффекту при общем облучении тела. Гибель контрольных мышей при дозах облучения от 12 до 13 Гр происходила в основном за счет потери клеток-предшественниц гемопоэза. Радиопротекторное действие IL-1 опосредовано появлением стволовых и гемопоэтических клеток вследствие повышенной экспрессии рецепторов к SCF [115].

Фактор роста гепатоцитов (SF) является инвазогенным и ангиогенным цитокином, участвующим в опухолевой прогрессии. Его рецептор — трансмембранная тирозинкиназа, кодируемая протоонкогеном c-Met. SF и IL-1 аккумулируются в различных опухолях, их высокий титр обнаруживается в большинстве злокачественных новообразований. SF защищает эпителиальные клетки, а также клетки рака легких от апоптоза, обусловленного ДНК-повреждающими агентами (ионизирующее облучение и доксорубицин). Кроме того, под действием SF более резистентными к радиации становятся стволовые клетки. Защитную активность SF связывают с его способностью блокировать угнетающее действие цитотоксинов на антиапоптотический протеин Bcl-xL.

Неоднозначна связь фактора некроза опухолей-α (TNF–α) с радиочувствительностью. Так, взаимодействие TNF–α со своими рецепторами I типа ведет к активации апоптотических каспаз и индукции апоптоза. Активация же TNF–α рецепторов II типа приводит к радиопротекторному эффекту посредством индукции экспрессии IL-1 и IL-6, которые, в свою очередь, активируют Akt киназу [115]. Наблюдается повышение экспрессии трех генов (Cyclin b1, Cyclin d1, Hiap), которые предположительно связаны с активацией транскрипционного ядерного κB-фактора, содействующего повышению жизнеспособности клеток [35].

Исследована роль экспрессии рецептора эпидермального фактора роста (EGF) в формировании радиорезистентности. Известно, что EGF принимает участие в клеточной пролиферации и дифференцировке. Гиперэкспрессия рецептора EGF наблюдается в различных злокачественных опухолях. Изменение его экспрессии и активности может привести к изменению чувствительности опухолей к химиопрепаратам и облучению. Для выявления предполагаемых изменений получен вектор, содержащий человеческий ген EGF, с использованием которого из родительской линии мышиных клеток карциномы эпителия яичника (OCA-I) получили клеточную линию с гиперэкспрессией рецептора EGF. В трансфектной линии радиорезистентность коррелировала с высоким уровнем экспрессии этого рецептора. Причем при действии на резистентную линию блокатора EGF рецептора – С225 наблюдалось повышение радиочувствительности клеток до уровня клеток родительской линии. Повышение уровня экспрессии рецептора ведет к усилению фосфорилирования сигнальной молекулы Akt, которая, в свою очередь, способствует выживанию клеток посредством инактивации таких ключевых составляющих апоптоза, как Bad (семейство Bcl-2) и каспаза 9 [115]. Кроме того, ионизирующая радиация индуцирует выброс трансформирующего фактора-α (TGF–α), который активирует EGF рецепторы. Такая радиационно-индуцированная активация EGF рецепторов задействует путь трансдукции сигнала Grb2/SOS/Ras/Raf/ER, что в дальнейшем активирует MAPK и ведет к усилению пролиферации и защиты от радиационно-индуцированной клеточной гибели. Таким образом, повышение экспрессии рецептора EGF — одна из причин, способствующих появлению в опухолевых клетках резистентности к ионизирующей радиации [46].

Несмотря на доказательства формирования перекрестной радио- и химиорезистентности опухолевых клеток различного гистогенеза [43, 90], она не выявлена в радиорезистентной B- лимфобластоидной сублинии [7]. Лейкозная Т-клеточная сублиния CEMRR, в 1,5 раза более устойчивая к радиации, чем родительская линия CEM, при наличии перекрестной резистентности к этопозиду, идарубицину и даунорубицину не была резистентна к таким цитостатикам, как цисплатин, таксотер и хлорамбуцил. Более того, лимфобластоидные сублинии, резистентные к этопозиду, винкристину, таксотеру, приобрели повышенную чувствительность к ионизирующей радиации [8, 10, 62, 135]. В то же время для клеточной линии рака легкого BCap37 не обнаружено синергического эффекта при одновременном воздействии γ-радиации и таксотера. Воздействие таксотера оказалось наиболее эффективным после предварительного циклического облучения клеточной линии. C другой стороны, культивирование клеток линий рака простаты DU145 и PC3 с ингибитором циклин-зависимой киназы флавоперидолом ведет к повышению чувствительности этих клеток к лучевому воздействию [33]. Очевидно, что резистентность клеток к одному повреждающему фактору не исключает повышения чувствительности к повреждающему фактору иной природы [11, 12]. Неоднозначность вероятности формирования перекрестной устойчивости опухолей к химио- и лучевой терапии выявляется и при изучении действия облучения на радиорезистентную J82 и нерадиорезистентную Т24 клеточные линии рака мочевого пузыря, которые под воздействием последовательной химио- и лучевой терапии обе оказались как химио-, так и радиорезистентными. Поэтому следует тщательно подбирать последовательность применения того или иного вида терапии, поскольку эффект чувствительности или нечувствительности для различных видов опухолей может оказаться противоположным. Во всяком случае возможность назначения химиотерапии при развившейся резистентности к ионизирующей радиации не исключается.

При исследовании молекулярных процессов, которые могут лежать в основе перекрестной химио- и радиорезистентности, усилия направлены прежде всего на выяснение роли гиперэкспрессии одного из белков МЛУ – P-gp 170, особенно учитывая тот факт, что в клетках со сверхэкспрессией P-gp 170 устойчивость к облучению может не изменяться, снижаться и увеличиваться [20]. Наряду с данными о том, что клеточные линии яичника китайского хомячка, отличающиеся высокой экспрессией P-gp 170, не изменили своей чувствительности к ионизирующему облучению, приводятся сведения о том, что линия острого Т-клеточного лимфолейкоза L100, обладающая фенотипом МЛУ, оказалась более чувствительной к γ-облучению и действию цисплатина или что субпопуляции клеток с фенотипом МЛУ линий 3Т3, IM-9/ER, IM-9/Vcr, IM-9/Tax заметно чувствительны к радиации [7, 10, 62], тогда как клетки опухолевой линии HeLa с фенотипом МЛУ и высокой экспрессией P-gp 170, а также трансфицированные геном Mdr1 клетки линии NIH 3T3 проявили меньшую чувствительность к ионизирующему излучению [117]. Резистентная к доксорубицину клеточная сублиния глиомы крыс, клетки которой обладали высоким уровнем экспрессии P-gp 170, стала устойчивой как к даунорубицину, винкристину и этопозиду, так и к ионизирующей радиации, что, однако, не удалось объяснить гиперэкспрессией P-gp 170 . В литературе встречаются данные о возможном вкладе белка MRP в формирование перекрестной радио- и химиорезистентности. Так, устойчивая к радиации Т-клеточная сублиния CEMRR обладала в 6 раз более высоким уровнем экспрессии MRP по сравнению с родительской линией CEM и оказалась резистентной к некоторым цитостатикам, хотя роль MRP и других белков МЛУ (BCRP и LRP) в перекрестной устойчивости к химио- и лучевому воздействию подвергается сомнению [8]. Амплификация гена Mdr1, кодирующего P-gp, может иметь место в клетках линий, химио- и радиорезистентных одновременно [67]. Однако полагают, что продукт гена Mdr1 – Р-gp делает клетку резистентной не только к химиопрепаратам, но и к -облучению, являющемуся индуктором Fas-опосредованного апоптоза. Облученные клетки, наряду с повышенной экспрессией белков МЛУ, способны обладать устойчивостью к винкристину и этопозиду, не изменяя своей чувствительности к облучению [100]. Вместе с тем факт обнаружения определенного увеличения экспрессии P-gp и некоторого увеличения LRP без повышения экспрессии BCRP в клетках радиорезистентной лимфобластоидной сублинии, которая при этом приобрела повышенную коллатеральную чувствительность к химиопрепаратам, свидетельствует о тканеспецифических особенностях молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимоотношений между химио- и радиорезистентностью [7, 8, 135, 136]. Глутатионовый и металлотионеиновый механизмы устойчивости новообразований к действию некоторых химических агентов также могут принимать участие в формировании перекрестной резистентности, поскольку способны защищать клетку от разрывов ДНК, вызванных ионизирующей радиацией и действием алкилирующих соединений, таких как цисплатин [133, 156].

Многие опухолевые клетки обладают своими специфическими энзимами, отвечающими за устойчивость к экзогенным воздействиям. Так, различные виды опухоли головного мозга характеризуются гиперэкспрессией тимидин-фосфорилазы. Этот фермент приводит к измененному синтезу ДНК, быстрой пролиферации раковых клеток и опухолевому ангиогенезу. Опухолевые клетки с высоким уровнем тимидин-фосфорилазы обладают устойчивостью к радиотерапии и цитостатикам, в частности к препаратам платины [80].

Мутации в генах, контролирующих клеточный цикл и апоптоз, придают опухолевой клетке резистентность не только к цитостатикам, но и к лучевой терапии, так как механизм их терапевтического действия заключается в повреждении ДНК, индуцирующем апоптоз. Так, резистентная к облучению и химиопрепаратам культура клеток мелкоклеточного рака легких обладала мутантным P53, повышенной экспрессией онкогенов n-Myc, Bcl-xl и протеинов MRP1 и MRP2, возможно, также связанными с фенотипом перекрестной резистентности. При этом наблюдалась гиперэкспрессия топоизомеразы II-α, которая, способствуя репарации ДНК, повышает устойчивость клеток к повреждениям ДНК химическими агентами и ионизирующей радиацией [67].

Один из механизмов формирования перекрестной резистентности связывают с нарушением в опухолевых клетках различных звеньев обмена церамида, который в качестве вторичного мессенджера также участвует в апоптозе [59]. Существует специфический метаболический путь сфингомиелина, являющегося компонентом плазматической мембраны и необходимого для активации апоптоза при химическом или лучевом воздействии на клетку. Путь начинается ферментативным гидролизом фосфодиэфирной связи сфингомиелина специфической сфингомиелиназой с последующим превращением сфингомиелина в церамид, который воздействует на свои мишени: церамид-активированную протеинкиназу, цитозольную протеинфосфатазу, МАРK, С-jun N-концевую протеинкиназу. Так происходит запуск сигнального каскада, формирование пор в митохондриальной мембране и выделение цитохрома С из митохондрий в цито-плазму с последующей активацией каспаз. Помимо апоптоз-индуцирующей активности церамид может вызвать арест клеточного цикла и выживание клетки [72, 104]. На радиорезистентной человеческой эритро-миелобластной клеточной линии показано резкое снижение образования церамида и несостоятельность церамид-обусловленного апоптоза под действием γ-облучения в сравнении с родительской линией [72]. В опухолевых клетках, резистентных к действию адриамицина и доксорубицина, происходит интенсивное превращение церамида в гликоцерамид. Подавление в таких клетках процесса превращения церамида в гликоцерамид с помощью специфических ингибиторов приводит к накоплению церамида в ответ на действие различных лекарственных препаратов и, в конечном итоге, к гибели клеток. На многочисленных примерах показано, что апоптотической гибели опухолевых клеток, обусловленной цитотоксическим эффектом ряда противоопухолевых агентов и облучения, предшествует накопление в них церамида [31].

Немаловажную роль в становлении перекрестной устойчивости играют ферменты, участвующие в репарации поврежденной ДНК. Показано, что АР-эндонуклеаза (Ape1/ref-1) человека, являющаяся мультифункциональным белком и участвующая в репарации ДНК, способна приводить к устойчивости опухолевых клеток как к химио-, так и к лучевой терапии. Трансфицированные геном АР-эндонуклеазы клетки линии эмбриональной карциномы TN2 благодаря гиперэкспрессии и повышению репарирующей активности Ape1/ref 1 были в 2–3 раза более устойчивы к цитостатику блеомицину и γ-радиации по сравнению с исходными клетками. Возможно, появление перекрестной резистентности связано не только с репарационными функциями энзима, но и с его способностью влиять на контроль клеточного цикла, трансдукцию сигнала, активацию P53, регуляцию транскрипционных факторов (Fos-Jun, NfκB, Myb и др.) [113].

Cпецифические энзимы Ku семейства, участвующие в репарации ДНК, вносят существенный вклад в формирование перекрестной резистентности опухолей к лучевой и химиотерапии. Как уже отмечалось, Ku-протеины, в частности Ku-70 и Ku-80, являются ДНК-репарирующими субъединицами DNA-PK. На клетках цисплатин-резистентной мышиной опухолевой сублинии показаны более высокая экспрессия и активность Ku-70 и Ku-80 протеинов в сравнении с родительской линией. Причем у этой сублинии наблюдалась стойкая резистентность к ионизирующему облучению, так как ее клетки обладали более высокой способностью к репарации двойных разрывов ДНК [57]. Таким образом, слабая экспрессия Ku-энзимов свидетельствует о низкой репаративной активности ДНК клеток и о высокой чувствительности новообразований к облучению, и наоборот, при высокой экспрессии этих белков надо ожидать, что опухоль будет радиорезистентной.

Таким образом, несмотря на возможность формирования перекрестной радио- и химиорезистентности, феномен устойчивости опухолевых клеток к одному виду терапии при сохранении или даже повышенной чувствительности к другому виду повреждающих факторов экспериментально и клинически подтвержден и используется в подходах по преодолению резистентности опухолей при применении комбинированных терапевтических воздействий [63, 73, 85, 115]. Среди актуальных проблем, требующих разрешения, — изучение эволюции не только множественной лекарственной, но и сочетанной (плейотропной) устойчивости к воздействиям различной природы при появлении резистентности к одному или нескольким терапевтическим факторам. Учет молекулярных механизмов возможной неоднонаправленной изменчивости чувствительности опухолевых клеток к повреждающим агентам позволит корректировать имеющиеся и разрабатывать принципиально новые схемы терапии опухолей, в том числе на основе индивидуально подобранных терапевтических доз и протоколов лечения.

Литература

1. Астрелина Т.А. // Гематология и трансфузиология. – 2000. – Т. 45, № 4. – С. 34–38.

2. Бережная Н.М., Чехун В.Ф. // Система интерлейкинов и рак. – Киев, 2000. – С. 163–170.

3. Бутенко З.А. // Онкология. – 2000. – Т. 2, № 1–2. – С. 141–143.

4. Копнин Б.П. // Биохимия. – 2000. – Т. 65, № 1. – С. 5–33.

5. Лукьянова Н.Ю., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. // Вопросы онкологии. – 2000. – Т. 46, № 2. – С. 121–128.

6. Мечетнер Е.Б. // Биологические мембраны. – 2003. – Т. 20, № 3. – С. 213–224.

7. Пасюков В.В. и др. // Рецепт. – 2006. –Т. 10, № 3. – С. 123—127.

8. Пасюков В.В. Перекрестная устойчивость опухолевых клеток к повреждающим факторам на модели полученных радио- и химиорезистентных лимфобластоидных сублиний: автореф. дис. … канд. биол. наук. – Минск, 2007.

9. Переводчикова Н.И. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний – М.: Практическая медицина, 2005. 

10. Свирновский А.И. и др. // Вестник фонда фундаментальных исследований. – 2000. – № 4. – С. 19–49.

11. Свирновский А.И. // Мед. новости. – 2003. – № 79. – С. 28—31.

12. Свирновский А.И. и др. // Мед. новости. – 2005. – № 9. – С. 5—16.

13. Свирновский А.И. и др. // Изв. НАН Беларуси. Сер. биол. наук. – 2006. – № 4. – С. 81—85.

14. Свирновский А.И. и др. // Изв. НАН Беларуси. Сер. мед. наук. – 2007. – № 2. – С. 72—78.

15. Сидорова Т.А., Солнцева Т.И. // Биологические мембраны. – 2003. – Т. 20, № 3. – С. 225–235.

16. Ставровская А.А. // Биологические мембраны. – 2003. – Т. 20, № 3. – С. 196–205.

17. Филов В.А. и др. // Вопросы онкологии. – 1999. – № 6. – С. 651–661.

18. Фильченков А.А. и др. // Эксперим. онкология. – 2001. – № 23. – C. 170–174.

19. Чехун В.Ф., Шишова Ю.В. // Онкология. – 2000. – Т. 2, № 1–2. – С. 11–15.

20. Шапошникова В.В. и др. // Биологические мембраны. – 2006. – Т.23, № 4. – С. 316–320.

21. Шман Т.В. и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2006. – Т. 141, № 6. – С. 676—680.

22. Штиль А.А. // Гематология и трансфузиология. — 2004. – Т. 49, №3. – С. 30–34.

23. Abdel-Rahman N. et al. // World J. Gastroenterol. – 2005. – V. 11. – P. 3020–3026.

24. Abraham R.T. // Genes and Development. – 2001. – V. 15, N 17. – P. 2177–2196.

25. Allen J.D., Schinkel A.H. // Mol. Cancer Therapeutics. – 2002. – V. 1. – P. 427–434.

26. Bennett C.B. et al. // Nat. Genet. – 2001. – V. 29, N 4. – P. 426–434.

27. Bible K.C. et al. // Clin. Cancer Research. – 2000. — V. 6. – P. 661–670.

28. Bond G. et al. // Current Cancer Drug Targets. – 2005. – N 5. – P. 3–8.

29. Bontemps-Gracz M.M. et al. // Acta Biomedical Polonica. – 2002. – V. 49, N 1. – P. 87–92.

30. Brognard J. et al. // Cancer Research. – 2001. – V. 61. – P. 3986–3997.

31. Bruno A. et al. // Cell Death Differ. – 1998. – N 5. —P. 172–182.

32. Buolamwini J.K. et al. // Current Cancer Drug Targets. – 2005. – N 5. — P. 57–68.

33. Camphausen K. et al. // Mol. Cancer Ther. – 2004. – N 3. – P. 409–416.

34. Caney C. et al. // Intern. J. Radiat. Biol. – 2004. – V. 80, N 4. – P. 291–299.

35. Chen X. et al. // Cancer Research. – 2002. – V. 62. – P. 1213–1221.

36. Cheol-Hee C. et al. // Cancer Cell Intern. – 2005. – V. 5, N 30. – P. 15–27.

37. Chrenek M., Wong P., Weaver M. // Breast Cancer Res. – 2001. – N 3. – P. 224–229.

38. Clynes M. et al. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 1998. – V. 28, N 3. – P. 181–205.

39. Condon L.T. et al. // Intern. J. Cancer. – 2002. – V. 100, N 4. – P. 472–475.

40. Coppola D. // Cancer Control. – 1999. – V. 6, N 4. – P. 385–392.

41. Damiano J.S. et al. // Blood. – 1999. – V. 93, N 5. – P. 1658–1667.

42. Da-Qiang L. et al. // World J. Gastroenterol. – 2004. – V. 10, N 12. – P. 1722–1725.

43. Davey R.A. et al. // Anticancer Research. – 2004. – V. 24. – P. 465–472.

44. Davis J.M. et al. // Clin. Cancer Research. – 2003. – V. 9. – P. 1161–1170.

45. Dean M. et al. // J. Lipid Res. – 2001. – V. 42, N 7. – P. 1007–1017.

46. Dent P. et al. // Mol. Biol. Cell. – 1999. – V. 10. – P. 493–506.

47. Ding Z. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2000. – V. 270, N 2. – P. 415–420.

48. Dorte L.N. // Dan. Med. Bull. – 2004. – V. 51. – P. 393–414.

49. Durig J. et al. // Leukemia. – 2001. – V. 15. – P. 752–756.

50. Ecker G., Chiba P. // Pure Appl. Chem. – 2004. – V. 76, N 5. – P. 997–1005.

51. Erin L. et al. // Cancer Research. – 2000. – V. 60. – P. 3514–3521.

52. Fang L. et al. // J. Med. Chem. – 2006. – V. 49, N 3. – P. 932—941.

53. Fedier A. et al. // Intern. J. Oncol. – 2004. – V. 24. – P. 1039–1047.

54. Filipits M. et al. // J. Clin. Oncol. – 2005. – V. 23, N 6. – P. 1161–1168.

55. Finn W.G. et al. // Hum. Pathol. – 2001. – V. 32. – P. 66–73.

56. Fishman M.N. et al. // Hematology.– 2001.– V. 5, N 5.– P. 343–358.

57. Frit P. et al. // Mol. Pharmacology. – 1999. – V. 56. – P. 141–146.

58. Garcia-Gila M. et al. // Clin. Exp. Immunol. – 2002. – V. 127. – P. 455–462.

59. Garzotto M. et al. // Cancer Research. – 1999. – V. 59. – P. 5194–5201.

60. Glynn S.A. et al. // Brit. J. Cancer. – 2004. – V. 91. – P. 1800–1807.

61. Gottesman M.M. // Annu. Rev. Med. – 2002. – V. 53. – P. 615–627.

62. Grigorovich S.A. et al. // Exp. Oncol. –2001. – V. 23, N 4. – P. 242—247.

63. Guido J.T. // Intern. J. Hematol. – 2002. – V. 76. – P. 334–336.

64. Gupta D. et al. // Leukemia. – 2001. – V. 15. – P. 1950–1961.

65. Hamdown M.H. et al. // Developmental Biology. – 2004. – V. 276. – P. 452–462.

66. Hegewisch-Becker S. et al. // Annals of Hematology. – 1996. – V. 72, N 3. – P. 105–117.

67. Henness S. et al. // Intern. J. Radiation Oncology Biol. Phys. – 2002. – V. 54, N 3. — P. 895–902.

68. Hideshima T. et al. // Semin. Oncol. – 2001. – V. 28. – P. 607–612.

69. Hill B.T. et al. // Anticancer Drugs. – 2000. – V. 11, N 3. – P. 193–200.

70. Hiroyuki T. et al. // The EMBO J. – 2002. – V. 21, N 19. – P. 5195–5205.

71. Huang L. et al. // Oncogene. – 2003. – V. 22. – P. 5848–5854.

72. Jaffrezou J.P. et al. // The FASEB J. – 2001. – N 15. – P. 123–133.

73. Jang S.H. et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2003. – V. 304, N 2. – P. 773–780.

74. Johnstone R.W. et al. // Trends Biochem. Sci. – 2000. – V. 25, N 1. – P. 1–6.

75. Kaina B. et al. // Intern. J. Clin. Pharmacol. Ther. – 2002. – V. 40, N 8. – P. 354–367.

76. Karran P. // Carcinogenesis. – 2001. – V. 22, N 12. – 1931–1937.

77. Kawabata S. et al. // Clin. Cancer Res. – 2003. – V. 9. – P. 3052–3057.

78. Kersemaekers A.F. et al. // J. Clin. Oncol. – 2002. – N 6. – P. 1551–1561.

79. Korystov Y.N. et al. // Eur. J. Pharmacol. – 2004. – V. 493, N 1–3. – P. 57–64.

80. Koukourakis M.I. et al. // Clin. Cancer Res. – 2006. –V. 6. – P. 381–389.

81. Kumar P. et al. // J. Biol. Chem. – 2004. – V. 279, N 41. – P. 43352–43360.

82. Lagneaux L. et al. // Blood. – 1998. – V. 91, N 7. – P. 2387–2396.

83. Leonard G. et al. // The Oncologist. – 2003. – V. 8, N 5. – P. 411–424.

84. Lin X. et al. // Mol. Cancer Ther. – 2006. – V. 5, N 5. – P. 1239–1247.

85. Liqun X. et al. // Can. Res. – 2004. – V. 64. – P. 221–228.

86. Liscovitch M. et al. // Drugs. – 2002. – N 5. – P. 349–355.

87. Little J.B. // J. Radiol. Prot. – 2003. – V. 23, N 2. – P. 173–181.

88. Liu B. et al. // World J. Gastroenterol. – 2001. –V. 7. – P. 855–859.

89. Liu J. et al. // Mol. Pharmacol. – 2001. – V. 60, N 2. – P. 302–309.

90. Locke V.L. et al. // Anticancer Drugs. – 2003. – V. 14, N 7 – P. 523–31.

91. Longley D.B. et al. // J. Pathol. – 2005. – V. 205. – P. 275–292.

92. Mahadevan D. et al. // Blood. – 2004. – V. 104, N 7. – P. 1940–1951.

93. Materna V. et al. // Intern. J. Cancer. – 2005. —V. 115, N 3. – P. 393–402.

94. Matsuyama А. et al. // Cancer Res. – 2001. – V. 61. – P. 5714–5717.

95. Mattern J. // Cancer Ther. – 2004. – V. 2. – P. 403–414.

96. Meyers M. et al. // Environ. Mol. Mutagen. – 2004. – V. 44, N 4. – P. 249–264.

97. Michalak K. // Cell. Biol. Mol. Lett. – 2001. – V. 6, N 2A. – P. 362–368.

98. Monk B.J. et al. // Gynecol. Oncol. – 2002. – V. 87, N 2. — P. 193–199.

99. Nefedova Y. et al. // Blood. – 2004. – V. 103, N 9. – P. 3503–3510.

100. Nielsen D. et al. // Intern. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. – 2001. – V. 51, N 4. – P. 1050–1057.

101. Oda S. et al. // Nucleic Acids Research. – 2005. – V. 33, N 5. – P. 1628–1636.

102. Olson D.L. et al. // Mol. Cancer Ther. – 2005. – V. 4, N 1. – P. 91–99.

103. Oscier D.G. et al. // Blood. – 2002. – V. 100. – P. 1177–1184.

104. Pallis M. et al. // Blood. – 2000. – V. 5, N 9. – P. 2897–2904.

105. Perwaiz M. // Pak. J. Med. Sci. – 2003. – V. 19, N 2. – P. 118–127.

106. Pery M.E. // Mol. Cancer Research. – 2004. – V. 2. – P. 9–19.

107. Pieters R. et al. // Leukemia. – 1999. – V. 13, N 12. – P. 2023–2030.

108. Ponce de Leon V. et al. // Cancer Cell Intern. — 2005. – V. 5, N 20. – P. 17–25.

109. Rajkumar S. et al. // Clin. Cancer Res. – 2000. – V. 6. – P. 3111–3116.

110. Rauth A. et al. // Intern. J. Rad. Oncol. – 2004. – V. 42, N 4. – P. 755–762.

111. Rayburn E. et al. // Current Cancer Drug Targets. – 2005. – N 5. – P. 27–41.

112. Riordan J.R. et al. // Nature Biotechnology. – 2000. – V. 18. – P. 18–20.

113. Robertson K.A. et al. // Cancer Res. – 2001. – V. 61. – P. 2220–2225.

114. Roepe P.D. // Novartis Found. symp. – 2001. – V. 240. – P. 232–247.

115. Rosen E. et al. // Oncology. – 2000. – V. 14, N 5. – P. 38–52.

116. Rumjanek V.M. et al. // Ann. Acad. Bras. Ciênc. – 2001. – V. 73, N 1. – P. 57–69.

117. Ruth A.C. et al. // Cancer Res. – 2000. – V. 60. – P. 2576–2578.

118. Salmon S.E. et al. // Basic and clinical pharmacology. – 9th ed. – New York, 2004. – P. 881–911.

119. Sarkadi B. // Physiol. Rev. — 2006. – V. 86. – P. 1179—1236.

120. Satyamoorthy K. et al. // Cell Growth and Differentiation. – 2000. – V. 11. – P. 467–474.

121. Saxena A. et al. // Amer. J. Obstet. Gynecol. – 2005. – V. 192, N 5. – P. 1399–1403.

122. Schwartz J.L. et al. // Rad. Res. – 2003. – V. 159, N 6. – P. 730–736.

123. Shain H.K. et al. // Mol. Cancer Ther. – 2001. – V. 1. – P. 69–78.

124. Shu H.G. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – V. 95. – P. 14453–14458.

125. Siegsmund M.J. et al. // Urol. Res. – 1999. – V. 27, N 3. – P. 157–163.

126. Solazzo M. et al. // Exp. Cell. Res. – 2006. – V. 312, N 20. – P. 4070–4078.

127. Sonneveld P. // Best Practice and Research Clinical Haematology. – 2003. – V. 16, N 4. – P. 629–644.

128. Stavrovskaya A.A. // Biochemistry. – 2000. – V. 65, N 1. – P. 95–106.

129. Stojic L. et al. // DNA Repair. – 2004. – V. 3, N 8–9. – P. 1091–1101.

130. Stromskaya T.P. et al. // Cancer Cell Intern. – 2005. – V. 5, N 15. – P. 56–64.

131. Stucki M. et al. // Cell. – 2005. – N 7. – P. 1213–1226.

132. Sui M. et al. // Clin. Cancer Res. – 2004. – V. 10. – P. 4848–4857.

133. Surowiak P. et al. // Folia Morphol. – 2003. – V. 62, N 4. – P. 493–495.

134. Suvannasankha A. et al. // Brit. J. Haematol. – 2004. – V. 127, N 4. – P. 392–398.

135. Svirnovski A.I. et al. // Exp. Oncol. – 2005. – V. 27, N 1. – P. 43–46.

136. Svirnovski A.I. et al. // Hematology. – 2005. – V. 10, N 4. – P. 313–319.

137. Szakacs G. et al. // Nature Reviews Drug Discovery. – 2006. – N 5. – P. 219–234.

138. Tada Y. et al. // Clin. Cancer Research. – 2000. – V. 6. — P. 4618–4627.

139. Takebayashi Y. et al. // Intern. J. Mol. Med. – 2001. – V. 7, N 4. – P. 397–400.

140. Tamamoto T. et al. // Intern. J. Radiation Oncology Biol. Phys. – 1999. – V. 44, N 4. — P. 905–909.

141. Thomas H. et al. // Cancer Control. – 2003. – V. 10, N 2. – P. 159–165.

142. Tongon G. et al. // Cancer Biol. Ther. – 2005. – V. 4, N 12. – P. 1325–1330.

143. Uchiyama-Kokubu N. et al. // Anticancer Drugs. – 2001. – V. 12, N 9. — P. 769–779.

144. Valeriani M. et al. // Anticancer Research. – 2006. – V. 26, N 3B. – P. 2429–2435.

145. Vander Borght S. et al. // J. Pathol. – 2005. – V. 207. – P. 471–482.

146. Vander Kolk D.M. et al. // Blood. – 2002. – V. 99, N 10. – P. 3763–3770.

147. Vispe S. et al. // Nucl. Acids Research. – 1998. – V. 26, N 12. – P. 2859–2864.

148. Walter R.B. et al. // Blood. – 2007. – V. 109, N 10. – P. 4168—4170.

149. Wan-Ching Y. et al. // Clin. Cancer Research. – 2004. – V. 10. – P. 8656–8664.

150. Wood R.D. et al. // Science. – 2001. – V. 291, N 5507. – P. 1284–1289.

151. Wu D. et al. // Ai Zheng. – 2003. – V. 22, N 4. – P. 441–444.

152. Wu H.I. et al. // Cancer Research. – 2004. – V. 64. – P. 3940–3948.

153. Wuchter C. et al. // Haematologica. – 2000. – V. 85. – P. 711–721.

154. Yan T. et al. // Cancer Res. – 2001. – V. 61. – P. 8290–8297.

155. Yang J.X. et al. // Ai Zheng. – 2002. – V. 21, N 8. – P. 872–876.

156. Yang P. et al. // J. Clin. Oncol. – 2006. – V. 24, N 11. – P. 1761–1769.

157. Yasui K. et al. // Cancer Res. – 2004. –V. 64. – P. 1403–1410.

158. Yoo-Jin K. et al. // Eur. J. Haematol. – 2002. – V. 68, N 5. – P. 272–280.