Трансплантация аллогенных гемопоэтических клеток является эффективным средством лечения ряда гематологических и онкологических заболеваний. Однако широкое применение этого метода зачастую сдерживается отсутствием HLA-совместимого донора. Высокий риск развития болезни «трансплантат против хозяина» после трансплантации гемопоэтических клеток от неродственного или не полностью HLA-совместимого родственного донора ограничивает успешное применение аллогенных гемопоэтических клеток.

Попытки увеличить количество и доступность доноров кроветворных клеток, а также уменьшить летальность от осложнений, связанных с аллогенной трансплантацией костного мозга (ТКМ) и трансплантацией стволовых клеток периферической крови (ТСКПК), привели к обнаружению альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток – крови, получаемой из плаценты и (или) пупочного канатика новорожденных (umbilical cord blood). Эта идея была предложена в 1983 г. Э. Бойзом (Аризонский университет, США), в 1984 г. были проведены эксперименты на животных, а в 1988 г. была выполнена первая успешная трансплантация клеток пуповинной крови (ПК) пациенту с анемией Фанкони.

Многочисленные исследования показали, что ПК является богатым источником гемопоэтических стволовых клеток. Содержание ранних и коммитированных кроветворных предшественников в ПК выше, чем в периферической крови взрослых, а по количеству гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц (КОЕ-ГМ) и их пролиферативному потенциалу ПК значительно превосходит периферическую кровь взрослых даже после мобилизации введением ростовых факторов. Пролиферативная активность и жизнеспособность клеток ПК в долгосрочных культурах клеток in vitro также выше по сравнению с клетками костного мозга (КМ) [13].

При сравнении содержания клеток СD34⁺ в КМ и ПК установлено более высокое их содержание в КМ (4,1±2,2% и 1,16±0,6% соответственно; Р=0,05). Однако в ПК отмечено значительное преобладание клеток с иммунофенотипами СD34⁺ HLA-DR^-, которые, как было показано в экспериментах на долгосрочной гемопоэтической культуре клеток, обладают более высоким пролиферативным потенциалом, чем клетки с иммунофенотипами СD34⁺ HLA-DR⁺ [16].

Клетки ПК с иммунофенотипом СD34⁺ СD38^- также относят к примитивным клеточным предшественникам и имеют более высокую клоногенную способность, чем тот же иммунофенотип КМ взрослого. Кроме того, клетки ПК с иммунофенотипом СD34⁺ СD38^- активнее отвечают на стимуляцию цитокинами – интерлейкином-3 (ИЛ-3), ИЛ-6, колониестимулирующим фактором (КСФ) и воспроизводят в 7 раз больше колоний в долгосрочных культурах, чем клетки КМ. Отдельные субпопуляции клеток СD34⁺ менее дифференцированы, на что указывает низкий уровень поглощения rh-123 (rh — родамин) [10].

В целом сочетание антигенов Thy-1, СD34⁺ и CD45RA свидетельствует о высокой пролиферативной способности кроветворных клеток, а их экспрессия на поверхности клеток ПК подтверждает принадлежность к стволовым клеткам. В ПК есть также клетки с иммунофенотипом СD34⁺, которые не несут на себе линейных антигенов [8]. Содержание таких клеточных популяций с антигенами СD34⁺/Lin^- составляет около 1% от общего количества клеток с иммунофенотипом СD34⁺. При дифференцировке эти кроветворные предшественники воспроизводят клетки В-лимфоидного и полипотентного миелоидного рядов, что также указывает на принадлежность к стволовым клеткам [7].

Таким образом, исходя из данных о высоком содержании стволовых клеток в ПК и их высокой репопулятивной способности, был сделан вывод о том, что кроветворные клетки ПК могут быть успешно использованы для аллогенной трансплантации.

При сравнении типов и функций иммунных клеток ПК с клетками периферической крови взрослых и КМ было высказано предположение, что иммунные клетки ПК менее зрелые и менее функционально активные по сравнению со своими «взрослыми» аналогами. Например, Т-клетки ПК проявляют меньшую цитотоксическую активность, чем клетки взрослых после первичной, вторичной и третичной аллогенной клеточной стимуляции. Более того, тогда как Т-клетки ПК, как и Т-клетки взрослых, отвечают на индуцирующее пролиферацию действие первичной аллогенной стимуляции, при воздействии вторичной аллогенной стимуляции Т-клетки ПК, в отличие от Т-клеток взрослых, становятся нечувствительными. Т-клетки взрослых пролиферируют при вторичной аллогенной стимуляции даже сильнее, чем при первичной [5].

В новейших исследованиях было показано, что ПК либо не содержит вообще, либо содержит в малом количестве клетки с фенотипом натуральных киллеров (НК) СD8+. Это позволяет говорить о меньшей аллогенной цитотоксичности клеток ПК [5]. В-лимфоциты ПК презентируют большое количество пустых молекул HLA II класса, в то время как В-лимфоциты взрослых нагружены пептидами [14]. И, наконец, экспрессия и продукция ИЛ-12 (критического цитокина в регуляции функций НК и Т-лимфоцитов) активированными мононуклеарами ПК гораздо ниже по сравнению с мононуклеарными клетками периферической крови взрослых [14]. Все это является возможным объяснением более низкой частоты и меньшей выраженности реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) при трансплантации клеток ПК по сравнению с трансплантацией гемопоэтических клеток из других источников.

Клиническими исследованиями доказано, что тяжелая РТПХ при использовании клеток ПК в качестве трансплантата встречается реже, чем при трансплантации клеток КМ и периферической крови. Это, по-видимому, связано с меньшей иммунореактивностью лимфоидных клеток ПК. Причем вполне удовлетворительные результаты были получены даже при трансплантациях с использованием клеток ПК от доноров с неполной HLA-совместимостью. Так, M. S. Cairo [6] привел данные о серии неродственных трансплантаций, где часть доноров и реципиентов была несовместима по одному, двум и даже трем HLA-антигенам. Полученные при этом результаты не только были сравнимы с результатами трансплантаций неродственного КМ, но и превосходили их по ряду показателей. Так, во всех группах степень хронической и острой РТПХ была ниже, чем в аналогичных по совместимости группах при проведении трансплантации неродственного КМ. С другой стороны, ослабление РТПХ может обусловить отсутствие или снижение связанного с ней эффекта «трансплантат против лейкемии», что теоретически может повлиять на результат трансплантации ПК больным лейкемией [12].

Приживаемость трансплантата ПК не ниже, чем КМ, даже при использовании меньшего числа вводимых гемопоэтических клеток (из расчета на 1 кг массы больного), что позволяет снизить степень выраженности РТПХ [6]. Вопрос об оптимальном количестве клеток ПК, необходимых для приживления в организме реципиента, до сих пор окончательно не решен.

Многочисленные исследования по оценке гематологического и иммунологического восстановления после трансплантации ПК показали, что восстановление Т-клеточного иммунитета и субпопуляции НК-клеток после трансплантации ПК в целом повторяет эти процессы при трансплантации клеток КМ [4]. Скорость же восстановления гематологических показателей после трансплантации ПК выше, чем после ТКМ и ТСКПК.

Таким образом, очевиден целый ряд преимуществ применения ПК для трансплантаций перед использованием других источников кроветворных клеток, а именно:

— отсутствует риск для здоровья матери и ребенка (донора);

— предоставляется большая возможность использования не полностью совместимых по HLA-системе трансплантатов;

— повышается вероятность нахождения редких HLA-типов трансплантатов, что имеет большое значение для некоторых этнических меньшинств;

— требуются меньшие затраты времени и средств для поиска необходимого HLA-типа трансплантата;

— значительно снижается риск передачи некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем;

— появляется экономически приемлемая форма страхования жизни в связи с возможностью использовать клетки ПК в качестве аутологичного трансплантата;

— становится возможным накопление стволовых клеток in vitro для генного модифицирования.

Следует отметить, что патология беременности не влияет на состав и качество пула кроветворных клеток и не является противопоказанием для их трансплантации. Более того, ПК недоношенных детей содержит большее количество гемопоэтических предшественников, чем ПК доношенных новорожденных, и характеризуется увеличением доли ранних и эритроидных предшественников гемопоэза, возрастанием пролиферативного потенциала гранулоцитарно-макрофагальных предшественников и содержания кроветворных ростовых факторов в плазме ПК [3].

Принципиальным недостатком ПК по сравнению с КМ является ограниченное количество гемопоэтических клеток, получаемых при одном заборе ПК (по различным данным, объем варьирует от 40 до 420 мл). Если для КМ потери клеточной массы в процессе сепарации, криоконсервирования, размораживания и тестирования допустимы в пределах 40—50%, то для ПК такие потери клеток недопустимы, так как при пересадке может возникнуть несостоятельность трансплантата. Некоторые авторы считают достаточным для трансплантации объем собираемой крови не менее 40 мл. Однако такое малое количество может быть пригодным лишь для пациентов с массой тела не более 10 кг, поэтому образцы объемом менее 60 мл рекомендуется сохранять в качестве потенциальных аутологичных трансплантатов или для реципиентов в возрасте до 1 года. По данным G. Kogler et al. [11], для трансплантаций при массе тела реципиента 10 кг (по результатам анализа 2098 собранных образцов ПК) потенциальными трансплантатами могут быть все образцы ПК, при массе 35 кг — 67%, и лишь 25% образцов смогут обеспечить больных с массой 50—70 кг.

В настоящее время в мире существует развитая система банков ПК, которые созданы для обеспечения оборудованием, персоналом и экспертизой всех мероприятий, связанных со сбором и хранением ПК для последующего клинического использования. Первый банк ПК основан в 1993 г. в Нью-Йорке. С тех пор разными банками применялись различные практические подходы к сбору, обработке и хранению образцов ПК. Многие аспекты хранения ПК изменяются в связи с новыми техническими достижениями, такими, например, как экспансия in vitro. По состоянию на май 2001 г. в банках хранилось более 4000 образцов ПК, и было проведено свыше 1500 трансплантаций с использованием этого материала [15].

Данные об имеющихся образцах ПК заносят в специальные регистры, доступные для международного медицинского сообщества. На 1 января 2000 г. насчитывалось 63 таких регистра, при этом в 44 регистра было включено свыше 6 млн потенциальных доноров КМ из 34 стран, а в 19 регистрах 13 стран содержались данные о 39 080 замороженных образцах ПК.

Однако до сих пор отсутствуют международные стандарты на получение и применение клеток ПК для трансплантации (для сравнения: еще в 1996 г. Американской ассоциацией банков крови (ААВВ) был опубликовано первое издание «Стандартов для гемопоэтических клеток-предшественников из КМ и периферической крови»). Данные многочисленных исследований о содержании кроветворных клеток-предшественников в трансплантатах ПК значительно расходятся, что может быть следствием различий как в используемых методах выделения и обработки мононуклеарной фракции, так и в способах количественной оценки содержания гемопоэтических клеток. Не решены также отдельные моральные и юридические вопросы донорства ПК, специфичные для здравоохранения каждой страны.

В Республике Беларусь только начато формирование Национального регистра типированных доноров костного мозга, криобанки КМ и ПК отсутствуют, что значительно затрудняет поиск совместимых доноров для больных и приводит к большим расходам по приобретению донорского КМ у зарубежных клиник. Создание Национального банка ПК позволило бы интегрироваться в международные программы по поиску и обмену образцами ПК и значительно снизило бы затраты на проведение неродственных трансплантаций гемопоэтических клеток. В то же время на пути к созданию банка ПК встают проблемы стандартизации методов забора, процессинга и криоконсервирования клеток ПК, а также оценки качества трансплантата, в том числе в процессе его длительного хранения.

В рамках нашего исследования забор ПК был осуществлен у 22 рожениц, давших согласие на участие в проекте (текст информированного согласия был разработан для данного проекта в соответствии с международными нормами). Три женщины отказались от участия в проекте без объяснения причин. Сбор анамнеза у рожениц проводили по стандартному плану, разработанному в соответствии с нормами, предъявляемыми к трансплантатам, в том числе к образцам ПК, и обеспечивающими их пригодность для хранения и последующего применения. Был подготовлен опросник, заполнение которого является обязательным этапом отбора донора ПК, что позволяет уже на этапе беседы исключить часть рожениц из исследования в связи с потенциальной угрозой непригодности гемопоэтических клеток пуповины для последующей трансплантации по причине возможной передачи различных заболеваний. Средний возраст женщин — 24,8 (18—35) года. У 18 женщин роды были первые, у 3 — вторые, у 1 женщины — третьи. Срок беременности у всех рожениц составил 38—41 неделю. Почти все женщины имели сопутствующие диагнозы или осложнения в ходе родов. Ни в одном случае не отмечено наличия наследственных, онкологических, гематологических, психических заболеваний у членов семьи роженицы или у членов семьи отца ребенка. Никто из включенных в исследование женщин не был в контакте за последний год с больными гепатитом, СПИД, гемофилией. Контролировался перечень принимаемых каждой женщиной перед родами и в ходе родов медикаментов.

Закрытая система для забора ПК представляла собой коллекционный мешок с устройством для взятия крови, рассчитанный на объем 120 мл и содержащий антикоагулянт следующего состава: 0,5 г декстрозы (водной), 0,41 г цитрата натрия (водного), 51 мл лимонной кислоты (водной), 35 мг одноосновного фосфата натрия, 4 мл аденина.

Нами были использованы две технологии сбора ПК — ex utero и in utero. Вена пуповинного канатика пунктировалась иглой, соединенной с коллекционным мешком, который после самопроизвольного стекания в него крови закрывался и переносился в транспортный контейнер. Еще один вариант сбора ПК — при кесаревом сечении — был исключен в связи с имеющимися данными о быстрой свертываемости крови внутри сосудов плаценты из-за выброса большого количества тканевого тромбопластина в ПК, обусловленного механической травматизацией последа при операции [2]. Был осуществлен забор 10 образцов ПК по методике ex utero и 12 образцов — по методике in utero. При использовании этих методик объемы получаемых образцов ПК отличались. Среднее количество ПК, собранной методом ex utero, составило 45,2 (34—63) мл, in utero — 64,6 (40—83) мл. С этой точки зрения более эффективным методом забора ПК является метод in utero, позволяющий собирать большее количество клеточного материала, хотя известно, что некоторые центры, в частности банк ПК в г. Санкт-Петербурге, производят забор пуповинной крови методом ex utero. Однако полученные данные показали, что метод забора in utero абсолютно безопасен для роженицы, по времени забора более быстр, дает большее количество пуповинной крови. Тем не менее следует отметить, что после отделения плаценты можно производить забор при любых, даже самых сложных родах, и эта манипуляция психологически более комфортна как для самой роженицы, так и для персонала. Для практической работы рекомендуются оба метода, причем метод забора in utero предпочтителен в неосложненных родах, а ex utero — при наличии осложнений.

Для осуществления необходимых лабораторных исследований кровь у женщин перед родами забирали в специально подготовленные (с консервантом либо без него в зависимости от вида исследования) одноразовые пробирки или флаконы с целью исключения возможной контаминации микроорганизмами или фрагментами чужеродной ДНК (для последующих молекулярно-биологических исследований). В образцах крови роженицы и ПК проводятся тесты на выявление следующих вирусов и (или) микроорганизмов:

·        сифилиса;

·        ВИЧ-1/2;

·        ВИЧ p-24 антиген;

·        HbsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В);

·        Anti-HBc (антитела к кор-антигену вируса гепатита В);

·        Anti-HCV (антитела к вирусу гепатита С);

·        Anti-CMV IgM (антитела IgM к цитомегаловирусу);

·        HTLV-I/II;

·        гемоглобинопатий (при необходимости).

Для определения HLA-фенотипа человека применяли тест комплементзависимого лизиса лимфоцитов (лимфоцитотоксический тест по Терасаки). Выявление HLA антигенов проводили с использованием панели, состоящей из 120 тестовых анти-HLA сывороток Белорусского республиканского центра иммунологического типирования органов и тканей, а также коммерческих панелей некоторых зарубежных фирм (Biotest, Fresenius, Lambda).

С целью определения экспрессии HLA-антигенов I класса на мононуклеарах плода типировано 16 образцов пуповинной крови и 18 образцов от матерей. В результате проведенного исследования выявлено 17 антигенов локуса А, 37 — локуса В и 7 — локуса С. Предварительный анализ результатов тканевого типирования показал, что на мононуклеарах плода экспрессированы практически все исследуемые HLA-антигены I класса. Однако в большинстве случаев можно было констатировать пусть и в незначительной степени, но более низкий уровень экспрессии изучаемых антигенов у плодов по сравнению с матерями и здоровыми людьми (донорами крови). Вместе с тем ни в одном случае не было затруднений при определении фенотипа мононуклеаров плода.

Оценивая результаты выделения мононуклеаров из пуповинной крови на градиенте фиколл-верографин, следует отметить не совсем четкое разделение эритроцитов и мононуклеаров. Во взвеси последних в большинстве случаев отмечалась большая примесь красных кровяных клеток. По-видимому, одной из причин этой особенности ПК является установленная в ряде случаев более низкая плотность поверхностного электрического заряда эритроцитов пуповинной крови и их большие размеры по сравнению с аналогичными клетками взрослых. Выдвинутое предположение нуждается в уточнении.

При определении титров изогемагглютининов в ПК подтвержден описанный в литературе факт их низкой серологической активности. Максимальный титр изогем-агглютининов 1:4 отмечен лишь в одном случае, в остальных тест-клетки агглютинировались только цельной сывороткой. Полученные данные позволяют упростить технологию подготовки трансплантата при малой и смешанной формах несовместимости в системе АВО, исключив из нее удаление плазмы крови как источника изогемагглютининов.

Для оценки количества ядросодержащих клеток, эритроцитов, мононуклеаров образцы ПК до и после сепарации исследовали на гематологическом анализаторе Cell-Dyn 3500 (Abbott, США) и в стандартном мазке на предметном стекле по унифицированной методике. Подсчет числа CD34⁺ клеток проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием мышиных моноклональных антител (МКА) против антигенов лейкоцитов человека (Becton Dickinson, США). Количественный анализ экспрессии маркерных антигенов выполняли в автоматическом режиме на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson) с помощью программы CellQuest не позднее 48 ч после фиксации клеток.

Процессинг ПК проводили путем пассивной седиментации эритроцитов в течение 1 ч при соотношении ПК и 6% раствора гидроксиэтилкрахмала 4:1 с последующим центрифугированием и удалением плазмы. В таблице приведены результаты оценки эффективности сепарации на 6% HES образцов ПК, включенных в исследование. Средний объем забранной ПК составил 55,8 (25—85) мл. В образцах ПК до сепарации содержалось (в абсолютных цифрах на 1 образец) в среднем 8,5х10⁸ ядросодержащих клеток (ЯСК), 2,8х10⁸ мононуклеаров и 0,21х10¹² эритроцитов. После проведения процедуры сепарации в образцах ПК содержалось (в абсолютных цифрах на 1 образец) 5,5х10⁸ ядросодержащих клеток, 1,6х10⁸ мононуклеаров и 0,07х10¹² эритроцитов.

Таким образом, процент выхода ЯСК после сепарации составил в изученных образцах 63,5%. При этом было удалено (в среднем по всем изученным образцам) около 65% эритроцитов. Относительно небольшой процент осаждения эритроцитов может объясняться наличием значительного разброса эффективности удаления эритроцитов, что не может быть отражено в усредненных значениях этого параметра. Изучение содержания CD34⁺ клеток в образцах ПК показало, что в них содержалось в среднем 0,17% CD34⁺ клеток, или (в абсолютных значениях) 0,96х10⁶. Эти показатели в целом согласуются с ранее опубликованными данными о значительно более высоком содержании CD34⁺ кроветворных клеток в ПК [1, 17].

Количество ЯСК, которое удалось получить в результате заготовки и сепарации изученных образцов ПК, также находится в пределах, позволяющих говорить о возможности использования данных образцов для трансплантации. Так, если исходить из критерия в (2—3)х10⁷ ЯСК на 1 кг массы реципиента [9], то полученного в наших условиях количества ЯСК — 5,5х10⁸ (усредненное значение для 22 образцов) — может теоретически хватить для проведения трансплантации ПК пациентам с массой тела до 22 кг (в среднем). Данный показатель для ряда образцов был значительно выше, тогда как отдельные образцы ПК содержали недостаточное для трансплантации количество ЯСК.

На основании проведенного исследования сформулируем следующие выводы:

1. Сбор сведений о роженицах—донорах пуповинной крови достаточно информативен и позволяет сделать предварительное заключение о возможности использования собранного материала в качестве трансплантата.

2. Методы забора пуповинной крови ex utero и in utero достаточно эффективны, каждый из них имеет свои преимущества, и оба могут быть рекомендованы для применения в зависимости от условий родов.

3. Постановка лабораторных тестов образцов крови роженицы и ПК, необходимых для проведения контроля качества трансплантата и его безопасности (HLA-типирование, тестирование на отсутствие вирусных и бактериальных инфекций и т.д.), позволяет на ранних этапах обеспечить выбраковку непригодных по различным критериям образцов ПК, а также выбор технологической тактики процессинга.

4. Отработанная базовая технология сепарации клеток ПК позволяет получать достаточное для последующей трансплантации количество кроветворных клеток.

5. Выявленная низкая серологическая активность в пуповинной крови может иметь важное значение для технологии подготовки трансплантата, позволяя при малой и смешанной формах несовместимости в системе АВО исключить из процессинга ПК удаление плазмы крови как источника изогемагглютининов.

Литература 

1.         Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. // Вопр. онкологии. — 2000. — Т. 46, № 5. — С. 513—520.

2.         Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. и др. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: М-лы науч.-практ. конф., СПб., 6—8 июня 2000 г. — С. 23—27.

3.         Замараева Н.В., Алексеев И.В., Владимирская Е.Б. и др. // Гематология и трансфузиология. — 1996. — Т.41, № 2. — С. 16—18.

4.         Arcese W., Aversa F., Bandini G. et al. // Haematologica. — 1998. — V. 83. — P. 159—182.

5.         Barren K., Broxmeyer H. E., McCullough J. et al. // Biology of Blood and Marrow Transplantation. — 2001. — V. 7. — P. 635—645.

6.         Cairo M.S., Wagner J. // Blood. — 1997. — V. 90, N 2. — P. 4665—4678.

7.         Cashman J., Bockhold K., Hogge D.E. et al. // Brit. J. Haematol. — 1997. — V. 98 (4). — P. 1026—1036.

8.         Di Giusto D.L., Lee R., Moon J. et al. // Ibid. — 1996. — V. 87 (1). — P. 1261—1271.

9.         Gluckman E., Ucha V., Yyer-Chammard A. et al. // Engl. J. Med. — 1997. — V. 337. — P. 373—381.

10.       Hogan C.J., Shpall E.J., McNulty O. et al. // Ibid. — 1997. — V. 90 (1). — P. 85—96.

11.       Kogler G., Sarnowski A., Werner P. // Bone Marrow Transplant. — 1998. — V. 22, Suppl. 1. — P. S14—S15.

12.       Ohnuma K., Isoyama K., Ikuta K. et al. // Brit. J. Haematol. — 2001. — V. 112, N 4. — P. 981.

13.       Pettengell R., Luft T., Henschler R. et al. // Blood. — 1994. — V. 846. — P. 3652—3659.

14.       Sirhia G., Rebulla P. // Haematologica. — 1999. — V. 84. — P. 738—747. 

15.       Stanworth S., Warwick R., Fehily D. // Vox Sanguinis. — 2001. — V. 80, N 4. — P. 236.

16.       Traycoff C.M., Abboud M.R., Laver J. et al. // Exp. Hematol. — 1994. — V. 22. — P. 215—222.