Стволовая клетка — это клетка-«родоначальник», способная генерировать несколько типов специализированных клеток, выполняющих специфические функции в организме (например, клетки головного мозга, мышечной ткани или крови). Изначальной стволовой клеткой является оплодотворенная яйцеклетка, способная генерировать все 220 видов клеток человеческого организма. Термин «коммитированные» относится к клеткам, генеририрующим некоторые, но не все типы клеток. Вторая особенность стволовых клеток — способность делиться и поддерживать неспециализированную линию в культуре.

Выделяют два вида стволовых клеток:

— эмбриональные стволовые клетки;

— стволовые клетки взрослого организма.

Эмбриональные стволовые клетки

В последнее время повысился интерес к эмбриональным стволовым клеткам, равным оплодотворенной яйцеклетке по способности генерировать широкий спектр клеток. Эти клеточные линии способны к длительной (год и более) недифференцированной пролиферации в культуре, а также в зависимости от условий среды могут трансформироваться в клетки различных типов (нервные, кишечника, мышечные, костные, хрящевые и др.).

В некоторых тканях взрослого организма (костный мозг, мышцы, головной мозг) различные популяции стволовых клеток генерируют замещение клеток, утраченных в процессе жизнедеятельности, повреждения или заболевания. Стволовые клетки взрослого не способны к длительной пролиферации в неспециализированной форме.

Полагают, что стволовые клетки могут быть основой терапии болезни Паркинсона, диабета и заболеваний сердца.

Учитывая, что эмбриональные стволовые клетки человека были выделены немногим более 4 лет назад, их фундаментальные свойства интенсивно изучаются по двум направлениям:

1) определение способности к самоподдержанию и самообновлению неспециализированных клеток в культуре;

2) идентификация сигналов, стимулирующих образование специализированных клеток.

Другой вид эмбриональных плюрипотентных клеток — зародышевые — получают на более поздней стадии развития: из плода 5—10 недель.

Гематология и трансфузиология традиционно имеют дело с гемопоэтическими стволовыми клетками и клетками-предшественниками.

До последнего времени считалось, что гемопоэтические стволовые клетки не могут формировать клетки других тканей, например нервной или мышечной. Однако во многих экспериментальных иследованиях выявлен феномен пластичности — способности стволовых клеток одной ткани генерировать клетки совершенно другой специфичности. В качестве примера можно привести развитие из клеток крови нейронов, печеночных инсулин-продуцирующих клеток и кардиомиоцитов. Таким образом, возможность использования стволовых клеток взрослого для клеточной терапии — зона повышенной активности экспериментальной биологии и медицины.

Культивирование эмбриональных стволовых клеток

Клетки, растущие в лабораторных условиях, называют клеточной культурой. Эмбриональные стволовые клетки человека (внутренняя клеточная масса бластоцита — приблизительно 30 клеток) помещают в пластиковую чашку со специальной питательной средой. Через несколько дней пролиферирующая клеточная масса заполняет чашку, после чего избыточные клетки аккуратно переносят в несколько других чашек со свежей питательной средой. Процесс переноса клеток (субкультивирование) повторяется многократно в течение многих месяцев. Цикл субкультивирования клеток называется пассаж. Спустя 6 мес и более из первичных 30 клеток внутренней клеточной массы образуются миллионы эмбриональных стволовых клеток. Эмбриональные стволовые клетки, пролиферация которых состоялась в клеточной культуре в течение шести и более месяцев без дифференцировки, остаются плюрипотентными, без генетических изменений и квалифицируются как линия эмбриональных стволовых клеток.

По мере формирования клеточных линий дозы клеток замораживаются и могут храниться и транспортироваться подобно замороженным гемопоэтическим клеткам.

Идентификация эмбриональных стволовых клеток

Для идентификации эмбриональных стволовых клеток используют несколько методов:

1) рост и субкультивирование стволовых клеток. Задача — убедиться, что клеточная линия самообновляется в течение длительного времени. При микроскопии оцениваются жизнеспособность и морфологические характеристики недифференцированных клеток;

2) поверхностный маркер Oct-4 — фактор транскрипции, участвующий в процессах клеточной дифференциации и эмбрионального развития;

3) анализ состояния хромосом при микроскопии. Задача — убедиться в отсутствии повреждений и изменения количества хромосом;

4) оценка плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток. С этой целью:

— оценивают способность клеток к спонтанной дифференцировке в культуре;

— создают условия для дифференцировки в специфические типы клеток;

— вводят клетки иммунокомпрометированной мыши для оценки образования тератомы — опухоли, обычно содержащей несколько дифференцированных видов клеток.

Для генерации специфических клеток создаются специальные составы питательных сред или изменяют подложки для культивирования, а также модифицируют клетки, вставляя специфические гены.

Стволовые клетки взрослого

Стволовые клетки взрослого — недифференцированные клетки, расположенные среди дифференцированных, способные к самообновлению и продукции основных специфических клеток ткани или органа. Их основная роль — замещать повреждение ткани, в которой они локализуются. Поэтому наряду с термином «стволовые клетки взрослого» используют термин «соматические стволовые клетки». В отличие от эмбриональных стволовых клеток происхождение стволовых клеток взрослого в зрелой ткани неизвестно.

Исследования стволовых клеток взрослого переживают своеобразный бум. Эти клетки выделяют из самых различных тканей, что создает основу для совершенствования методов трансплантации стволовых клеток. Фактически кроветворные стволовые клетки взрослого пересаживают около 30 лет.

Локализация и функция стволовых клеток взрослого

Стволовые клетки взрослого представлены в очень небольшом количестве в каждой ткани. Возможно, они локализуются в определенных областях, где могут оставаться в состоянии покоя и начинать делиться после активации сигналами повреждения ткани. Показано наличие стволовых клеток в следующих тканях: головной мозг, костный мозг, периферическая кровь, кровеносные сосуды, скелетные мышцы, кожа, печень.

В многочисленных лабораторных исследованиях ведется поиск оптимальных путей культивирования стволовых клеток и генерации специализированных клеток для лечения патологических процессов. Примеры потенциального применения таких клеток: замещение дофамин-продуцирующих клеток при болезни Паркинсона, инсулин-продуцирующих клеток при диабете I типа и миокардиоцитов при некрозе сердечной мышцы.

Идентификация стволовых клеток взрослого

Согласованных критериев идентификации стволовых клеток взрослого не выработано. Трансплантация стволовых клеток — термин, обобщающий несколько различных, наиболее часто используемых методов:

1) метка клеток живой ткани молекулярными маркерами и определение типов специализированных клеток, которые они генерируют;

2) удаление клеток животного, метка их в клеточной культуре и трансплантация другому животному с оценкой способности клеток репопулировать их исходную ткань;

3) изоляция клеток, их культивирование с добавлением различных факторов роста или введением новых генов с оценкой типов образующихся дифференцированных клеток.

Обычная дифференциация

Гемопоэтические стволовые клетки дают начало всем типам клеток крови: эритроцитам, Т- и В-лимфоцитам, натуральным киллерам, нейтрофилам, базофилам, эозинофилам, моноцитам/макрофагам и тромбоцитам; клетки стромы костного мозга (мезенхимальные стволовые клетки) — костным клеткам (остеоциты), хрящевым клеткам (хондроциты), жировым клеткам (адипоциты) и другим видам клеток соединительной ткани, например ткани сухожилий.

По такому же принципу функционируют стволовые клетки других тканей: нервной, эпителия кишечника, кожи и т.д.

Пластичность и трансдифференциация

Доказанная экспериментально способность стволовых клеток дифференцироваться в разные типы клеток различных тканей называется пластичностью, или трансдифференциацией. Гемопоэтические стволовые клетки могут дифференцироваться в три основных типа клеток головного мозга — нейроны, олигодендроциты и астроциты, а также в клетки скелетной мускулатуры, миокардиоциты, гепатоциты; клетки стромы костного мозга — в миокардиоциты и клетки скелетной мускулатуры; стволовые клетки головного мозга — в клетки крови и скелетной мускулатуры.

Понимание механизмов трансдифференциации стволовых клеток взрослого — основа нового терапевтического подхода к замещению поврежденных тканей аутологичными стволовыми клетками другой ткани.

Аллогенные трансплантаты стволовых клеток (от HLA-совместимого донора):

— клетки-предшественники костного мозга;

— клетки-предшественники периферической крови;

— клетки-предшественники пуповинной крови и плаценты.

Аутологичные трансплантаты стволовых клеток (от самого пациента):

— клетки-предшественники костного мозга ;

— клетки-предшественники периферической крови.

Показания к трансплантации стволовых клеток постоянно расширяются (табл. 1, см. бумажную версию журнала), поэтому знание этой технологии необходимо все большему числу медицинских работников. Аллогенные трансплантаты получают от HLA-совместимых родственных и неродственных доноров.

В настоящее время в Европе ежегодно в 350 центрах выполняется около 18 тыс. пересадок костного мозга. Прогресс в аллогенных трансплантациях в последние годы связан с созданием международных донорских регистров и внедрением методов ДНК-типирования в подбор пар «донор — реципиент».

В начале 1980-х годов было обнаружено, что стволовые клетки в небольшом количестве циркулируют в периферической крови. По сравнению с заготовкой костного мозга получение стволовых клеток периферической крови менее травматично, и во многих учреждениях отдают предпочтение этой процедуре. Клетки-предшественники периферической крови получают врачи-трансфузиологи, используя современные аппараты цитафереза.

Существенное количество стволовых клеток содержится в пуповинной крови. Преимущества этого источника — простота получения и низкая иммуногенность трансплантата. Отрицательная сторона — недостаточное количество стволовых клеток для взрослого реципиента. Первая пересадка клеток-предшественников пуповинной крови выполнена E. Gluckman в 1988 г. ребенку с анемией Фанкони. К настоящему времени проведено более 1500 трансплантаций клеток-предшественников пуповинной крови детям, увеличивается число таких пересадок взрослым. В банках пуповинной крови находится более 30 тыс. доз. Анализ работы 121 центра трансплантации в 29 странах показал, что пересадка клеток-предшественников пуповинной крови от неродственного несовместимого донора столь же эффективна, как и пересадка костного мозга крови от неродственного донора.

В случае рецидива гемобластоза после аллогенной трансплантации с целью индукции процесса «трансплантат против опухоли» используют дополнительные трансфузии донорских лейкоцитов. При хроническом миелолейкозе эта процедура позволяет добиться ремиссии в 60—80% случаев. Для максимального эффекта “трансплантат против лейкоза” (с минимизацией риска болезни «трансплантат против хозяина») разработана схема посттрансплантационного введения лимфоцитов донора, обедненных CD8-клетками.

Преодолеть период посттрансплантационной цитопении без трансфузий концентрата тромбоцитов невозможно. Принципиальное значение имеет количество клеток в концентрате тромбоцитов (КТ), полученном от одного донора. Фактически, если используется КТ, приготовленный на современном аппарате цитафереза (содержание клеток (8—9) х 1011), то, как правило, достаточно 2—4 трансфузий. При использовании КТ, содержащих (2—3) х 1011 клеток, количество трансфузий увеличится в 2—3 раза.

Совершенствование поддерживающей терапии реципиентов стволовых клеток связано с внедрением гемопоэтических ростовых факторов, более эффективных антибиотиков, антигрибковых и антивирусных препаратов, иммунодепрессантов. Прогресс также связывают с ранней диагностикой вирусных (в первую очередь цитомегаловируса) и грибковых инфекций.

При всех видах трансплантации служба крови, как правило, осуществляет процедуры, связанные с криоконсервированием клеток-предшественников (вне зависимости от их источника). Именно технология длительного хранения гемопоэтических клеток без потери их функциональной активности стала ключевым условием аутологичной трансплантации — наиболее распространенного вида процедур, при котором нет проблем иммунологической совместимости, болезни «трансплантат против хозяина», риска передачи инфекций от донора.

В современном Центре крови целесообразно создание службы стволовых клеток, деятельность которой схематично представлена в табл. 2 (см. бумажную версию журнала).

Ближайшие перспективы технологии трансплантации стволовых клеток:

— лабораторное культивирование стволовых клеток с целью расширенного использования донаций пуповинной крови и увеличения количества аутологичных клеток;

— «очистка» аутологичного трансплантата от опухолевых клеток;

— расширение показаний для трансплантации (солидные опухоли, тяжелые аутоиммунные заболевания);

— расширенное использование протоколов «мини-трансплантации»: после менее интенсивной химиотерапии (лучевой, комбинированной) вводятся лимфоциты (стволовые клетки) донора для элиминации оставшихся опухолевых клеток;

— расширение использования HLA-несовместимых доноров.

Литература 

1.         Жибурт Е.Б. Трансфузиология: Учебник. — СПб.: Питер, 2002. — 736 с.

2.         Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б. Безопасное переливание крови. — СПб.: Питер, 2000. — 320 с.

3.         Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови / Под ред. Е.Б. Жибурта; Пер. с англ. — М.; СПб.: БИНОМ «Невский диалект», 2000. — 448 с.

4.         Bron D., De Bruyn C., Lagneaux L. et al. // Bull. Mem. Acad. R. Med. Belg. — 2002. — V. 157. — P. 135—145.

5.         Dhot P.S., Sirohi D., Ganguli P. et al. // Vox Sang. — 2002. — V. 83, Suppl.2. — P. 94.

6.         Giraud Ch., Korach J.M., Andreu G. et al. // Transfus. Clin. Biol. — 2002. — V. 9. — P. 186—228.

7.         Keil F., Elahi F., Greinix H.T. // Transfusion. — 2002. — V. 42. — P. 581—587.

8.         Lasky L.C., Lane T.A., Miller J.P. et al. // Transfusion. — 2002. — V. 42. — P. 1261—1267.

9.         Rebulla P. // Transfusion. — 2002. — V. 42. — P. 1246—1248.

10.       Woodard P., Lubin B., Walters C.M. // Pediatr. Clin. North Amer. — 2002. — V. 49. — P. 989—1007.

11.       Zubair A.C., Silberstein L., Ritz J. // Transfusion. — 2002. — V. 42. — P. 1096—1101.