Генодиагностика — относительно новый раздел диагностики, который позволяет обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Метод генодиагностики возник гораздо позже методов, основанных на микробиологических и иммунологических принципах [1—4, 10]. Его возможности и области применения представлены в современной медицинской литературе не в полном объеме. Целью данного обзора является оценка современного состояния генодиагностики и сфер ее применения, недоступных при использовании классических методов.

В 1953 г. Дж.Уотсон и Ф.Крик опубликовали работу, посвященную структуре ДНК, в которой указывалось, что основной принцип, лежащий в основе живой материи, — принцип комплементарности [14, 22]. Однонитевая цепь ДНК взаимодействует только с цепью ДНК, обладающей комплементарной последовательностью, и образует двунитевой комплекс [9, 20]. Этот принцип широко и успешно используется для решения различных научных проблем, в том числе для идентификации патогенных микроорганизмов.

Основой генодиагностики до конца 80-х годов была реакция гибридизации, для ее проведения необходимо было располагать клонированной последовательностью ДНК, используемой в качестве молекулярного зонда, который должен быть специфичным по отношению к ДНК тестируемого микроорганизма, а также по возможности соответствовать гену, кодирующему синтез одного из факторов патогенности. При использовании молекулярного зонда, удовлетворяющего этим требованиям, можно не только идентифицировать микроорганизм, но и дать заключение об его вирулентном потенциале и эпидемиологической значимости, что особенно важно при исследовании микроорганизмов, выделяемых из объектов внешней среды. В состав молекулярного зонда с помощью ферментов или химическим путем вводят легко тестируемые метки: радиоактивный изотоп, флюоресцирующий краситель, молекулы тяжелого металла или белок, обладающий ферментативной активностью [25—27].

Использование молекулярного зондирования позволило в значительной степени изменить ряд представлений о диагностике инфекционных заболеваний. Было доказано, что тестирование генов факторов патогенности во многих случаях гораздо более информативно по сравнению с исследованием различных фенотипических свойств, таких как определение серотипа, фаготипа, способности агглютинироваться в присутствии специфических сывороток, которые далеко не всегда отражают корелляционные связи с вирулентностью исследуемого микроба [4].

Однако метод генодиагностики, основанный на реакции гибридизации ДНК с ДНК, не отличается высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать 104—105 мишеней (это могут быть бактериальные клетки, вирусные частицы или очищенная нуклеиновая кислота) в пробе, поэтому данный подход малоинформативен при диагностике инфекционных состояний, при которых концентрация микробов ниже порога чувствительности метода, а сами микробы в силу тех или иных причин не размножаются в лабораторных условиях. С такими ситуациями микробиологам приходится сталкиваться повсеместно, например при диагностике хронических инфекционных состояний, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов. Те же трудности приходится преодолевать при идентификации практически всех внутриклеточных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы, требующие для своего культивирования очень сложных питательных сред либо клеточных или тканевых культур [4, 5, 10, 16].

Следующим шагом молекулярной биологии было создание способа исследования, получившего название «полимеразной цепной реакции» (ПЦР), не только позволяющего преодолевать вышеперечисленные трудности, но и открывающего новые возможности для лечения и эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний [11, 14, 35, 41]. Этому открытию сопутствовало развитие некоторых технологий, в частности появление приборов, автоматически синтезирующих одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды). В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментная система, в частности ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность вплоть до 95°С, а именно такая температура необходима для проведения ПЦР [2—4].

После открытия ПЦР она была очень быстро внедрена в практику. Метод стал настолько популярен, что сегодня уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования [31, 32]. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Если в недавнем прошлом для расшифровки последовательности ДНК размером в 250 пар нуклеотидов (п.н.) требовалась неделя, то современные лазерные секвенаторы позволяют определять до 5000 п.н. в день. Это в свою очередь способствует значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК. В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки возможных применений метода [11—14, 22].

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К.Мюллисом [9, 11, 14]. В основе метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК по принципу комплементарности, который является маркерным для данного вида возбудителя. In vivo ПЦР включает несколько стадий:

1. Денатурация ДНК.

2. Образование коротких двухцепочечных участков ДНК.

3. Синтез новой цепи ДНК.

При многократном повторении циклов репликации происходит увеличение числа копий фрагмента ДНК. Все это позволяет из единичных клеток микроорганизмов, содержащихся в анализируемом биологическом материале, получить необходимое количество ДНК для их идентификации.

Таким образом, полимеразная цепная реакция — это многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидфосфатов, солевого буфера и нуклеотидных праймеров, определяющих границы синтезируемого участка [1—3, 10, 14, 16, 22].

Каждый цикл синтеза (амплификации) состоит из трех этапов, протекающих в различных температурных режимах.

1-й этап. Денатурация ДНК — расплетение двойной спирали при температуре 93—95°С в течение 30—40 с.

Одна из цепей (+) используется в качестве основной матрицы. Ее пять штрих-концов фиксируются ферментом ДНК-полимеразой, что обеспечивает построение из отдельных нуклеотидов второй цепи ДНК, комплементарной первой. То же самое, только в обратном направлении, происходит и на второй нити ДНК, однако, поскольку расплетение молекулы ДНК идет в обратном порядке, новая цепь строится небольшими фрагментами, которые затем сшиваются. Для того чтобы фермент ДНК-полимераза начал свою работу, требуется наличие затравки или праймера — небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, который, соединяясь с комплементарным участком одной из цепей родительской ДНК, образует стартовый блок для наращивания дочерней нити.

2-й этап. Отжиг — присоединение праймеров при температуре 50—650С в течение 20—60 с.

Праймер — это химически синтезированные затравки олигонуклеотидной природы для полимеразной цепной реакции, определяющие границы амплифицируемого участка ДНК-матрицы и комплементарные противоположным ее цепям. При его разработке требуется найти фрагмент молекулы ДНК, который отличался бы генетической консервативностью и присутствовал бы только у интересующего нас вида микроорганизмов, при этом длина фрагмента должна составлять примерно 20 п.н. Подбор праймеров определяет специфичность: чем длиннее праймер, тем выше специфичность реакции. Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы. В соответствии с найденной последовательностью нуклеотидов синтезируется праймер.

Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям специфического фрагмента на противоположных нитях ДНК. Температура отжига является специфической для каждой пары праймеров. Ее значения обычно находятся в интервале 50—65°С. Точно рассчитанная и экспериментально проверенная температура отжига праймеров — одна из определяющих специфичность реакции характеристик, исключающих присоединение праймеров к не полностью комплементарным последовательностям.

Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК может идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для работы ДНК-полимеразы на второй цепи тоже требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера. Фактически праймеры, присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Такие фрагменты ДНК называются ампликонами. Длина ампликона может составлять несколько сот нуклеотидов. Меняя пару праймеров, мы можем переходить от анализа одного возбудителя к анализу другого.

3-й этап. Элонгация — достраивание цепей ДНК при температуре 70—72°С в течение 20—40 с.

Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках (коротких двунитевых участках). Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой олигонуклеотиды длиной около 20 п.н., также называемые праймерами. Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними.

Комплементарное достраивание цепей ДНК идет в направлении от 5`-конца к 3`-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит вносимый дезоксирибонуклеотидфосфат. Этот процесс катализируется ферментом Tag-полимеразой. Образовавшиеся в первом цикле синтеза новые ДНК служат исходным материалом для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона) и т.д.

Накопление ампликонов происходит по формуле 2п, где п — число циклов амплификации. Их может быть 25—40 (в среднем 30). Следовательно, если в начальном растворе находилась одна ДНК, то после 30 циклов их будет 108. Этого количества достаточно для их достоверной идентификации методом электрофореза в агарозном геле. Если в пробе отсутствуют молекулы ДНК с участком, комплементарным внесенным праймерам, то, хотя в растворе будет находиться миллион других молекул ДНК, их амплификации не будет.

ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах (процессу биологической амплификации), при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 105—106 раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективными, поддерживающими рост только одного микроорганизма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микробов, так и праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными и с их помощью можно выявить род или семейство микроорганизмов [3].

ПЦР имеет принципиальное преимущество перед культуральными методами. Диагностические возможности ее не ограничены способностью микроорганизма расти на искусственных средах или в культуре клеток, поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (так как чувствительность этих методов сопоставима), а в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим количеством различных микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам определять культуральными методами [2, 5, 23, 24, 28].

Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаруживать единичные бактериальные клетки или вирусные частицы [10, 16]. Преимущество ПЦР уместно рассматривать при сравнении с другими молекулярно-генетическими или иммунологическими методами диагностики. Чувствительность и специфичность метода ПЦР-диагностики зависят от способа приготовления образца, возможного присутствия ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, а также объема образца в пробах.

В настоящее время применяется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР [36]. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание—оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, точнее, природой его клеточной стенки. Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная В.R.Marmion et al. (1993). Она включает ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и осаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК, однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из наиболее популярных является метод выделения ДНК, предложенный R.Boom et al. (1990), основанный на использовании для лизиса клеток сильного лизирующего агента — гуанидина тиоционата (GuSCN) и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого числа стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, поскольку возможна перекрестная контаминация между пробами и образующимся аэрозолем ДНК.

При классической процедуре фенольно-хлороформной экстракции ДНК достигается хорошая очистка ДНК, в первую очередь от ингибиторов Tag-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex (США), которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, мешающие реакции [34]. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, возможно использование простых способов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время использование подобных методов для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам вследствие применения в реакционной смеси некачественного препарата ДНК [36]. Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

Во время следующей процедуры — амплификации — образец, содержащий ДНК возбудителя, вносится в небольшую пробирку с компонентами, обеспечивающими протекание полимеразной реакции, два вида праймеров, два энзима (Таg-полимераза и N-урацил-гликолаза) и четыре вида нуклеотида A, Г, Ц, У. Для проведения полимеразной реакции используется специальное устройство (термоциклер или ДНК-амплификатор), позволяющее автоматически, по определенной программе изменять температурный режим реакционной смеси. В первом цикле осуществления ПЦР образец нагревается до температуры 94°С для разделения двух комплементарных нитей ДНК. Затем температура снижается до 40—60°С, при которой праймеры присоединяются к единичной цепи ДНК, после чего температура вновь поднимается до 72°С, когда наиболее выражена активность полимеразы. Весь цикл с изменением температуры продолжается менее 3 минут [12, 14, 22, 41].

Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30—35 циклов [40]. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что встречается нечасто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенный на сегодняшний день — электрофорез, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5—2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК [22]. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 минут до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 — 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

В качестве «положительного контроля» используют стандарт ДНК искомого микроорганизма. Размер неспецифических ампликонов может быть как больше, так и меньше по сравнению с «положительным контролем». В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные [40].

«Положительный контроль» позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. В то же время препарат ДНК, подготовленный для ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью, для чего используют дополнительный, так называемый «внутренний контроль», который представляет собой любой стандарт ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма [5, 6].

Для инфекционных тест-систем иногда, например, используют р-глобиновый ген, к концам которого с помощью генноинженерных манипуляций пришивают участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. Если «внутренний контроль» внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК «внутреннего контроля» в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то, независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, «внутренний контроль» станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси свидетельствует о нормальном прохождении реакции амплификации и отсутствии ингибиторов. Если ампликоны нужного размера и «внутреннего контроля» не образовались, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК [35].

Несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Так, если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с «внутренним контролем» за праймеры. Это принципиально важно при низких концентрациях ДНК в исследуемом образце и может приводить к ложноотрицательным результатам. Тем не менее, при условии решения проблемы конкуренции за праймеры этот способ контроля эффективности амплификации, безусловно, будет весьма полезен [36].

Обсуждая возможности ПЦР, необходимо рассмотреть использование этого метода для преодоления трудностей, возникающих при диагностике возбудителей инфекционных заболеваний с характерным дрейфом поверхностных антигенов. Многие патогенные бактерии, такие как гонококки, менингококки, боррелии, микоплазмы и ряд других, противостоят иммунной системе организма хозяина, поскольку постоянно изменяют антигенную структуру поверхностных детерминант, способных индуцировать протективный иммунный ответ. Молекулярный механизм, обеспечивающий постоянную изменчивость поверхностных структур, хорошо изучен и получил название кассетного механизма [46].

Антигенный дрейф позволяет микроорганизму постоянно уходить от атаки иммунной системы, пролонгируя инфекционный процесс, переводя его в хроническую стадию. Однако при постоянной смене антигенных детерминант начинают вырабатываться низкоавидные антитела на константные части антигенов. Бактериальной клетке необходимо принять решение — сдаться в этой борьбе или найти еще какой-либо механизм, позволяющий уйти от атаки иммунной системы. Такой механизм действительно существует. Используя технологию ПЦР, удалось продемонстрировать, что у персистирующих форм микоплазм выключается экспрессия генов, кодирующих синтез антигенных детерминант, что, безусловно, отрицательно сказывается на их потенции к размножению, но в то же время дает возможность сохраниться, пролонгируя инфекционный процесс [7, 8].

Из вышеизложенной стратегии взаимодействия бактерий с макроорганизмом совершенно очевидно, что как культуральные, так и иммунологические методы диагностики малоэффективны при обнаружении бактерий, использующих такие способы борьбы с макроорганизмом [42, 48]. В то же время эти приспособительные реакции микроорганизма никак не влияют на эффективность диагностики, осуществляемой с помощью ПЦР.

В связи с этим уместно привести данные по сравнительной оценке диагностической эффективности различных лабораторных методов обнаружения Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealуticum при урологических и гинекологических заболеваниях. По этому вопросу имеется множество публикаций [24—28]. Их обобщение показывает, что эффективность обнаружения Ureaplasma urealуticum при помощи ПЦР у больных с диагнозами хронических воспалительных заболеваний гениталий, бесплодия, простатита в 3 раза выше, чем у микробиологических методов выявления, и в 2 раза выше, чему у РИФ и РАГА. Вместе с тем их эффективность при обнаружении этих же бактерий при остром инфекционном процессе была примерно одинаковой. Аналогичные данные получены и для других микоплазм.

Таким образом, тест-системы, основанные на принципе ПЦР, гарантируют наиболее высокую диагностическую эффективность обнаружения персистирующих форм микроорганизмов. Более того, подходы, основанные на ПЦР, дают возможность непосредственно работать с генетическим материалом микроорганизмов, находящихся в этом физиологическом состоянии, что уже сегодня позволяет изучать молекулярно-генетические механизмы, определяющие стратегию взаимодействия персистирующих микробов с организмом хозяина [3, 10].

Говоря о диагностических возможностях ПЦР применительно к персистирующим формам микробов, нельзя обойти вниманием проблему диагностики урогенитального хламидиоза. При этом заболевании, вызываемом Chlamydia trachomatis, бессимптомное носительство является нормой. Какие молекулярные механизмы позволяют микроорганизму реализовать такую стратегию выживания, неизвестно, но ПЦР начинает занимать лидирующее место в диагностике этого заболевания [1—4, 23].

В настоящее время преимущество ПЦР-анализа перед «золотым стандартом» (культуральный метод обнаружения микроорганизмов) состоит в следующем:

1. Более высокая частота обнаружения микроба, превышающая аналогичный показатель при использовании культурального метода, на 6—7%. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма.

2. Время, необходимое для обнаружения возбудителя культуральным методом, составляет около 4 суток, тогда как использование ПЦР позволяет обнаружить микроб через 4—5 часов.

3. Использование технологии ПЦР позволяет проводить определение возбудителей, например хламидий, в образцах, взятых неинвазивным путем, например в порциях мочи [18, 39].

Диагностика заболеваний, передающихся половым путем, с помощью иммунологических и бактериологических методов существенно затруднена, так как эта область инфекционной патологии по понятным причинам насыщена стертыми, хроническими, недолеченными формами [36]. Вместе с тем названные трудности не отражаются на эффективности диагностики, осуществляемой с применением ПЦР, поэтому можно прогнозировать, что ПЦР в ближайшее время займет лидирующие позиции в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, передаваемых половым путем.

В последнее время технология ПЦР стала применяться не только в целях диагностики и оценки эффективности лечения, но и для выбора рациональной антибиотикотерапии [3, 18, 29, 43, 44]. Использование ПЦР для определения антибиотикорезистентности актуально в случае труднокультивируемых микроорганизмов [15, 45]. В настоящее время уже описаны праймеры и тест-системы, позволяющие определять наличие генов, детерминирующих устойчивость к тетрациклину и эритромицину у целого ряда патогенных микроорганизмов [17, 18].

Механизмами формирования у микроорганизмов резистентности к антибактериальным агентам являются мутационные изменения или интеграция в геном нового генетического материала, несущего детерминанты устойчивости к антибиотикам. Так, устойчивость микроорганизмов к препаратам группы тетрациклина определяется tet-M- и tet-O-детерминантами, которые обнаруживаются у изменения конформации рибосом, вследствие чего сродство препарата к местам узнавания на рибосоме падает. Эти детерминанты обнаружены у грамположительных и грамотрицательных бактерий и обеспечивают защиту клетки от тетрациклина путем изменения конформации рибосомы так, что сродство антибиотика к местам узнавания резко снижается. Микроорганизмы могут приобретать гены устойчивости к тетрациклинам от грамположительной флоры человека. Предполагают, что конъюгативный перенос tet-M-детерминанты осуществляет транспозон Tn 916, обнаруженный в хромосомах бактерий родов Enterococcus, Streptococcus; перенос tet-O гена происходит благодаря наличию конъюгативных плазмид [20, 43, 44].

Устойчивость возбудителей к макролидам определяется генами, детерминирующими синтез метилтранс-фераз, которые способны изменять сайты распознавания антибиотиков — 23S рибосомальную РНК. Перенос к возбудителям генов резистентности к макролидам также осуществляют мобильные генетические элементы — транспозоны. Устойчивость к одному из препаратов групп макролидов и тетрациклинов указывает на нецелесообразность использования других антибиотиков этой группы ввиду перекрестной устойчивости [21, 29, 33, 47].

Учитывая вышесказанное, сформулируем направления исследований в инфекционной патологии, в решении которых ПЦР начинает играть ведущую роль [3, 37].

1. Диагностика хронических инфекционных состояний, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов. Это наиболее очевидная область применения ПЦР в диагностических целях.

2. ПЦР — незаменимый инструмент при идентификации и молекулярно-генетических исследованиях практически всех внутриклеточных и мембранных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы.

3. ПЦР — наиболее эффективный метод для выявления и изучения возбудителей, которые, находясь в «некультивируемом» состоянии, способны там сохраняться, переживая неблагоприятные внешние условия.

4. ПЦР позволяет проводить определение антибиотикорезистентности у медленно растущих и труднокультивируемых бактерий.

Перспективными направлениями практического использования ПЦР-диагностики являются:

·        диагностика онкологических заболеваний;

·        диагностика лейкемий и лимфом;

·        диагностика рака молочной железы;

·        диагностика других злокачественных заболеваний;

ДНК-диагностика доброкачественных и злокачественных новообразований ограничивается небольшим, но все возрастающим числом сведений о генах, ассоциированных с этими заболеваниями;

·        диагностика генетических заболеваний.

Диагностика генетических заболеваний может развиваться только вслед за проведением широких научных исследований генома человека. Однако медицинское сообщество уже осознало важность изучения генетической основы заболеваний, а также возможность диагностирования и начала лечения болезни до появления ее симптомов;

·        идентификация личности: судебная медицина, криминалистика; трансплантация органов и тканей; определение отцовства. Эксперты оценивают это направление на рынке ДНК-диагностикумов как одно из наиболее крупных и быстрорастущих;

·        диагностика патогенов в пище.

Сектор рынка ДНК-диагностики патогенов в пище в настоящее время является самым скромным. На ДНК-диагностику микробного загрязнения производимых продуктов питания приходится менее 5% от общего числа методов, применяемых для тестирования загрязненности продуктов (культуральные методы и методы с использованием моноклональных антител). Однако методы ДНК-диагностики, по оценкам экспертов, более быстрые, точные и информативные, что в ближайшее время, по-видимому, приведет к резкому росту доли данного сектора рынка ДНК-диагностики [3, 10].

Таким образом, технология ПЦР — мощный инструмент, обеспечивающий возможность изучения и диагностики хронических инфекционных процессов, экологии возбудителей инфекционных заболеваний. Метод ПЦР-диагностики дополняет уже существующие приемы микробиологической диагностики, качественно меняет методологию решения прикладных проблем медицинской микробиологии и эпидемиологии.

Литература 

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 1993. — № 4. — С.3.

2. Аксенов М.Ю., Мисуренко Е.Н., Шустрова Н.М. и др.// Журнал микробиологии. — 1995. — № 2. — С. 80—83.

3. Гинцбург А.Л. // Микробиология, иммунология и вирусология. — 1999. — №5. — С. 22—26.

4. Гинцбург А.Л., Брюханов А.Ф. и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 1987. — № 11. — С. 9—13.

5. Грижебовский Г.М., Четина Е.В., Брюханов А.Ф., Гинцбург А.Л. // Здоровье населения и среда обитания. — 1994. — № 4 (13). — С. 13—14.

6. Гришина Т.Л., Шагинян И.А., Пузанов В.А. и др. // Молекулярная генетика. — 1995. — № 1. — С. 36—39.

7. Зигангирова Н.А., Соловьева С.В., Раковская И.В. и др. // Генетика. — 1995. — Т. 31, № 8. — С. 1059—1064.

8. Зигангирова Н.А., Раковская И.В., Неустроева В.В. и др. // Журнал микробиологии. — 1996. — № 3. — С. 39—42.

9. Ллуелин М.Б. // Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. — М.: Мир,1999. — С. 428—447.

10. Лопухов Л.В., Эйдельштейн Н.В. // Клин. микробиология и антимикроб. химиотерапия. — 2000. — Т.2, № 3. — С. 96—106.

11. Макреди Б.Дж., Чимера Д.А. // Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. — М.: Мир, 1999. — С. 496—506.

12. Олецкий Э.И., Таганович А.Д. Современные методы молекулярной биологии и их прикладное значение. — М.: Мед. книга, 1999. — 56 с.

13. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 1993. — № 6. — С. 34—37.

14. Саики Р., Гиленстен У., Эрлих Г. // Полимеразная цепная реакция. Анализ генома. Методы. — М.: Мир,1990. — С.176—190.

15. Сидоренко С.В. // Антибиотики и химиотерапия. — 1999. — Т. 44, № 12. — С. 19—22.

16. Скала Л.З. Современные аспекты клинической микробиологии. — М., 1999. — 323 с.

17. Скрипкин Ю.К., Кубанова А.А., Аковбян В.Н. и др. // Антибиотики и химиотерапия. — 1996. — Т. 41, № 2. — С. 5—8.

18. Соловьева С.В., Гой Е.Г., Зигангирова Н.А // Клиническая лабораторная диагностика. — 2000. — №1. — С. 43—46.

19. Соловьева С.В., Зигангирова Н.А., Гончарова СЛ. и др. // Журнал микробиологии. — 1994 (Приложение). — С. 60—64.

20.Уимсон Дж., Хант Т. Молекулярная биология клетки. — М.: Медицина, 1994. — 322 с.

21. Хейз Дж., Волер С. Молекулярная генетика устойчивости к лекарственным препаратам. — М.: Медицина, 1997. — 412 с.

22. Херрингтон С., Макгли Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. — М.: Мед. книга, 1999. — 433 с.

23. Четина Е.В., Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М. и др. // Журнал микробиологии. — 1992. — № 3. — С. 21—24.

24. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 1993. — № 6. — С. 18—22.

25. Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Токарская О.Н. и др. // Журнал микробиологии. — 1991. — № 6. — С. 25—29.

26. Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. // Генетика. — 1995. — Т. 31, № 5. — С. 600—610.

27. Шагинян И.А., Нестеренко А.Н., Терехов А.А. и др. // Генетика. — 1994. — Т. 30, № 5. — С. 627—634.

28. Щербо С.Н., Макаров В.Б. // Клиническая лабораторная диагностика. — 1998. — № 2. — С. 13—15.

29. Arthur M., Molinas С. // Antimicrob. Agents Chemother. — 1990. — V. 34. — P. 2024—2026.

30. Boom R., Sole J.A. Salimans M.M. et al. // J.Clin.Microbiol. — 1990. — V. 28. — P. 495—503.

31. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. // Bio. Technology. — 1991. — V. 9. — P. 553—557.

32. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. // Clin.Microbiol. — 1992. — V. 38, N 2. — P. 70—76.

33. Cockerill E.R. // Antimicrob Agents Chemother. — 1999. — V. 43, N 5. — P. 199—212.

34. Colucci G. // Benchmark. — 1995. — V. 2, N 2. — P. 3—9.

35. Frediricks D.N., Relmen D.A. // Clin .Infect.Dis. — 1999. — V.29, N 10. — P. 457—488.

36. Griffi H.G., Griffin A.M. PCR Technology. Current Innovations. — CRC Press, 1994.

37. Jashek G., Gaydos C.A., Welsh L., Quinn T.C. // Clin. Microbiol. — 1993. — V. 31, N 11. — P. 1209—1212.

38. Marmion B.R., Willlamson J., Wors-Wich D.A. et al. // Clin. Infect. Dis. — 1993. — V. 17, N 1. — P. 90—99.

39. Miettinen A. // Benchmark. — 1995. — V. 2, N 2. — Р. 5—13.

40. Mills K.B., Faloona F.A. // Biotechnol. — 1991. — V.155. — P. 335—350.

41. Owen R.J. // Med. Microbiol. — 1991. — V.30, N 2. — P. 89—99.

42. Pfaller M.A., Herwaldt L.A. // Clin. Infect. Dis . — 1997. — V.25, N 14. — P. 858—870.

43. Roberts M.C. // Trends in Microbiol. — 1994. — V. 2. — P. 353—357.

44. Roberts M.C. et al. // Mol. Cell. Prob. — 1993. — V. 7. — P. 387—393.

45. Scarpellini P., Braglia S., Brambilla A.M. et al. // Clin. Microbiol. — 1997. — V.35, N 17. — P. 2802—2806.

46. Stull T.L., LiPuma J.J., Edling T.D. // Clin.Infect. Dis. — 1998. — V.157, N 7. — P. 280—286.