В настоящее время энтеровирусные инфекции (ЭВИ) продолжают оставаться одной из актуальнейших проблем вирусологии, что обусловлено заметной и многоликой ролью их возбудителей в структуре патологии человека. Всего род Enterovirus насчитывает более 70 серотипов человеческих вирусов [9], являющихся возбудителями широкого круга заболеваний (полиомиелит, асептический менингит, гастроэнтерит, герпангина, эпидемическая миалгия) [1]. Как показали исследования последних трех десятилетий, энтеровирусы (ЭВ) могут вызывать не только давно известные формы, но и быть причиной патологий, считавшихся ранее неинфекционными. По современным представлениям, этиопатогенез хронического миокардита, дилатационной кардиомиопатии (ДКМП), инсулинзависимого диабета первого типа, хронической воспалительной миалгии связывается с персистентной ЭВИ [2—4].

Безусловным «золотым стандартом» в диагностике ЭВИ является выделение вирусов на культурах чувствительных клеток. Однако данная процедура весьма трудоемкая, длительная (до 28 дней) и не всегда заканчивается успешно. Особую трудность представляет выделение вируса из ликвора больного, хотя при подозрении на энтеровирусный асептический менингит обнаружение ЭВ (или его компонентов) в спинномозговой жидкости — основной диагностически значимый маркер. При наличии в организме пациента персистентной энтеровирусной инфекции (хронический миокардит, ДКМП, диабет) выделить вирус не представляется возможным вообще, так как персистентная ЭВИ не сопровождается образованием полноценного вирусного потомства [10]. В таких случаях для диагностики ЭВИ широко используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), обладающая весьма высокой чувствительностью. Однако иногда количество вирусного материала в исследуемых образцах может быть ниже детектируемого ПЦР (например, вследствие несоблюдения условий хранения или транспортировки клинического материала). Для определения низких количеств вирусной РНК в пробах применяется гнездовая модификация ПЦР, позволяющая повысить чувствительность в 10 000 раз [6,8]. Но введение второго раунда амплификации и соответственно необходимость манипуляций с уже амплифицированным материалом может вести к значительному увеличению частоты ложноположительных результатов вследствие кросс-контаминации (из пробирки в пробирку). Этот недостаток существенно ограничивает область применения метода гнездовой ПЦР, делая его слишком рискованным для проведения рутинных исследований. Тем не менее существует реальная возможность решить эту проблему с помощью постановки ПЦР и гнездовой ПЦР в одной пробирке. Данный метод разработан и достаточно широко применяется в отношении целого ряда патогенов [5, 7], но до настоящего времени для диагностики ЭВ не использовался.

Цель исследования — разработка метода гнездовой ПЦР в одной пробирке для детекции ЭВ и сравнение чувствительности различных модификаций ПЦР в отношении ЭВ при исследованиях клинического материала, для которого выделение вирусов на культуре клеток является заведомо проблематичным.

Отработку метода гнездовой ПЦР в одной пробирке и определение чувствительности различных модификаций ПЦР проводили с использованием нескольких штаммов ЭВ из коллекции музея НИИ эпидемиологии и микробиологии, в том числе Коксаки В3, ЕСНО 6, ЕСНО 9, ЕСНО 30. Полные нуклеотидные последовательности геномных РНК энтеровирусов человека были получены из баз данных Entrez и EMBL.

Анализ нуклеотидных последовательностей, подбор и оценку праймеров осуществляли с использованием компьютерной программы PrimerPremier 5.0. (Applied Biosystems), определяющей эффективность работы праймеров по совокупности показателей (наличие димеров и кросс-димеров праймеров, шпилечных структур, сайтов неспецифического праймирования и сайтов самопраймирования ДНК-матрицы с определением вероятности образования конечных продуктов и их энтропий).

Выделение РНК из исследуемых образцов проводили с использованием коммерческого продукта «TRI Reagent» производства «Sigma» в соответствии с инструкцией. Реакцию обратной транскрипции осуществляли в соответствии с инструкциями фирм-производителей обратной транскриптазы («Sigma», «Fermentas»). ПЦР для детекции РНК ЭВ осуществляли стандартным методом согласно ранее описанным протоколам постановки [10]. Модифицированный метод гнездовой ПЦР в одной пробирке проводили с использованием «горячего» старта (с добавлением воска или с применением hot-start Taq polymerase («Sigma»)) в режимах (94оС 40 с, 63оС 40 с, 72оС 1 мин) 36 циклов — для 1-го раунда амплификации (94оС 40с, 34оС 40с, 72оС 1 мин) и 42 цикла — для 2-го раунда. Продукты амплификации выявляли с помощью электрофореза в агарозном геле после окрашивания бромистым этидием.

В работе использовали образцы ликвора от больных серозным менингитом (n = 13), аутоптаты сердца больных хроническим миокардитом (n = 8) и ДКМП (n = 5). Все архивные материалы были предварительно исследованы и показали положительный результат в отношении мРНК β-актина, что указывало на сохранность РНК и возможность их использования для диагностики ЭВ.

Первый этап нашего исследования состоял в разработке метода гнездовой ПЦР в одной пробирке. Для этого был проведен анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов ЭВ, полученных из базы данных GenBank («Entrez»), и поиск праймерных последовательностей, соответствовавших следующим критериям:

— величина фрагмента, ограничиваемого наружной парой праймеров, должна быть достаточной для подбора соответствующей внутренней пары праймеров;

— разница между температурами отжига наружной и внутренней пары должна составлять не менее 20°С для разделения первого и второго раундов амплификации;

— праймеры должны обладать высокой эффективностью для максимальной чувствительности реакции;

— амплифицируемый участок должен располагаться в пределах высококонсервативного региона Генома ЭВ для детекции любого из более чем 100 серотипов ЭВ.

В результате проведенного анализа нами были выбраны две пары праймеров: наружная пара (НП) и внутренняя пара (ВП). НП праймеров имела оптимальную температуру отжига 63^оС и позволяла накапливать фрагмент размером 481 п.н., расположенный в пределах высококонсервативного участка 5’ нетранслируемого региона генома ЭВ. ВП праймеров (температура отжига 34оС) ограничивала внутренний фрагмент длиной 287 п.н. Разница в 29^оС между температурами отжига для НП и ВП была достаточной для разделения двух раундов ПЦР.

Следующим этапом исследований стало изучение чувствительности различных модификаций метода ПЦР в условиях эксперимента (моделирование ЭВИ в культуре клеток) и при использовании их в клинической диагностике ЭВИ.

Чувствительность разработанного нами метода гнездовой ПЦР в одной пробирке, а также методов гнездовой ПЦР и ПЦР в их традиционной постановке определяли при заражении музейными штаммами вирусов чувствительных культур клеток (множественность инфицирования 0,5 БОЕ/мл). Вышеуказанные методы использовали для выявления «—» цепи РНК ЭВ в зараженных клетках. Оказалось, что с помощью ПЦР «—» РНК ЭВ обнаруживали спустя 48 часов после заражения. Применение двух видов гнездовой ПЦР (классической и разработанной нами) позволило обнаружить вирусную РНК через 24 часа, когда количество синтезированной в клетках «—» РНК ЭВ было недостаточным для выявления его обычной ПЦР. Полученные результаты свидетельствуют об увеличении чувствительности метода ПЦР при использовании его гнездовых модификаций и о возможности их применения для детекции энтеровирусной РНК в клиническом материале, содержащем крайне низкие количества ЭВ.

Специфичность гнездовых модификаций метода также была более высокой по сравнению с ПЦР в классической постановке. Так, ни в одной из постановок не наблюдалось накопление неспецифических фрагментов ДНК. При этом разработанный нами метод оказался значительно более надежным, чем гнездовая ПЦР в традиционной постановке: в 15% проб после постановки гнездовой ПЦР в двух пробирках были получены ложноположительные результаты, вероятно, связанные с кросс-контаминацией ампликонами первого раунда реакции, тогда как при использовании модифицированной гнездовой ПЦР ложноположительные результаты не выявлялись.

Сравнение чувствительности вышеуказанных методов при рутинной диагностике ЭВИ проводили на различных образцах клинического материала (ликворы больных серозным менингитом, аутоптаты сердца больных хроническим миокардитом и ДКМП) (рисунок, см. бумажную версию журнала). Полученные результаты показали, что разработанный нами метод обладал наиболее высокой чувствительностью: с его помощью РНК ЭВ удалось детектировать в 76,9% ликворов (10 из 13) и 38,46% аутоптатов сердца (5 из 13), в том числе у 25% больных хроническим миокардитом (2 из 8) и 60% больных ДКМП (3 из 5). При исследовании этих же материалов методом классической гнездовой ПЦР количество выявленных положительных проб ликворов и аутопсий сердца больных хроническим миокардитом совпадало с обнаруженным ранее (76,9% и 25% проб соответственно), тогда как у больных ДКМП РНК ЭВ была обнаружена лишь в 40% проб, что свидетельствует о более высокой чувствительности разработанного нами метода по сравнению с традиционно используемым. Применение для диагностики ЭВИ ПЦР (без внутренней пары праймеров) не увенчалось успехом ни в одном случае при исследовании ликворов и было малоэффективным (15,8%) при детекции ЭВ в аутоптатах сердца.

Таким образом, полученные результаты показали, что среди различных модификаций метода ПЦР наиболее чувствительным является разработанный нами метод гнездовой ПЦР в одной пробирке. Использование двух последовательных раундов специфической амплификации значительно снижает вероятность получения ложноположительных результатов вследствие накопления неспецифических продуктов реакции. Кроме того, возможность контаминации ампликонами в методе, разработанном нами, такая же низкая, как и в ПЦР в ее классической постановке (1-й раунд), тогда как чувствительность данного метода значительно более высокая. Все вышеизложенное позволяет рекомендовать использование разработанного нами метода для рутинной диагностики ЭВИ, особенно при работе с материалом, содержащим низкие количества РНК ЭВ (ликворы, архивные материалы, биоптаты).

Литература 

1.      Бочаров Е.Ф., Ерман Б.А., Фомин В.В. и др. Энтеровирусная инфекция: новые аспекты. — Новосибирск: Наука, 1990. — 224 с.

2.      Bowles N.E., Richardson P.J., Olsen E.G. et al. // Lаncet. — 1986. — V.1, N 8490. — P. 1120—1123.

3.      Foulis A.K., Farquharson M.A., Cameron S.O. at al. // Diabetologia. — 1990. — V. 33. — P. 290—298.

4.      Kandolf R., Klingel K., Zell R. еt al. // Intervirology. — 1993. — V. 35. — P. 140—151.

5.      Mahmoud M.S., Abdel-Aziz S.S., El-Sherif E.A., Swidan K. // J. Egypt Soc. Parasitol. — 1999. — V. 29 (3). — P. 1031—1046.

6.      Medical virology: The practical Approach Series / Ed. by U. Desselberger. — Oxford Univ.: IRL Press, 1995. — 214 p.

7.      Tan W., Xia N., Cong Y. // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. — 1998. — V.12, N 2. — P. 176—178.

8.      Taylor M.J., Godfrey E., Baczko R. et al. // J. Gen. Virol. — 1991. — V. 72, N 1. — P. 83—88.

9.      Virus Taxonomy: the Classification and Nomenclature of Viruses. The 7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / Ed. by M.H.V.Van Regenmortel, C.M.Fauquet, D.H.L. Bishop et al. — San Diego: Acad. Press, 2000. — 1167 p.

10.     Wessely R., Henke A., Zell R. et al. // Circulation. —1998. — V. 98. — P. 450—457.