Цереброваскулярные заболевания ишемического генеза имеют тенденцию к росту, омоложению, сопряжены с тяжелым клиническим течением, высокими показателями инвалидности и смертности. За последнее десятилетие достигнуты большие успехи в повышении эффективности лечения ишемического инсульта, однако им сопутствовало значительное количество неудач при клинической апробации нейропротективных средств [21]. Это позволяет считать поиск новых подходов к терапии острого ишемического инсульта одной из актуальных проблем экспериментальной и клинической неврологии.

Патогенез церебральной ишемии включает многочисленные звенья, достаточно хорошо изученные. Основные из них — снижение энергопродукции с нарушением активного транспорта различных ионов через мембраны, отклонения в функции эксайтотоксических медиаторов возбуждения в структурах мозга, возрастание уровня ионизированного кальция в нейроне [1, 44]. В настоящее время в патогенезе ишемии головного мозга (ГМ) рассматриваются механизмы повреждения нервных клеток, связанные с нейротоксичностью глутамата, опосредованной монооксидом азота (NO) [20]. Связь NО с нейромедиаторной функцией глутамата служит основанием для детального изучения роли этого мессенджера в патогенезе ишемии ГМ и последующего развития инсульта [20, 42].

Исследования последних лет показали, что NО – высокотоксичная в больших концентрациях молекула, обладающая широким спектром биорегуляторного действия в низких и умеренных количествах.

В настоящее время изучение биологических эффектов NО ведется по четырем главным направлениям: 1) исследование природы «расслабляющего фактора из эндотелия» (EDRF — endothelium derived relaxing factor); 2) механизм так называемой неадренергической, нехолинергической передачи в нервной системе; 3) иммуногенная цитотоксичность макрофагов; 4) метаболизм вазодилататорных нитратов.

NО синтезируется в ответ на физиологическую потребность с помощью фермента NО-синтазы (NОS) из его метаболического предшественника — аминокислоты L-аргинина. Процесс образования NО происходит путем двухстадийной реакции ферментативного окисления гуанидиновой группы L-аргинина с образованием промежуточного продукта — L-гидроксиаргинина. На следующей стадии реакции стехиометрически образуется L-цитруллин и NО в свободнорадикальной форме [3, 8, 13]. L-цитруллин затем вновь рециклируется, пополняя внутриклеточные запасы аргинина [34]. Оксид азота в свою очередь стимулирует растворимую гуанилатциклазу и другие гемсодержащие белки, что ведет к образованию цГМФ, вызывающего через активацию протеинкиназ соответствующие эффекты в клетках-мишенях [33, 34]. При этом установлено влияние образующегося оксида азота на активность NOS по механизму отрицательной обратной связи. В свободном состоянии NO — короткоживущая молекула (период полужизни колеблется от 6 до 30 с): она быстро метаболизируется — окисляется до NO₂ и более высоких окисей азота. В растворимом состоянии NO подвергается окислению с переходом в нитриты и нитраты. Из этого следует одно важное заключение: биологические эффекты NO ограничены местом его синтеза. Известно несколько изоформ NOS: конститутивная, постоянно присутствующая в ткани (сNOS), и индуцибельная (iNOS); по локализации в тканях выделяют нейрональную (nNOS), эндотелиальную (еNOS) и макрофагальную (macNOS) изоформы. Если первые две относятся к конститутивным, то macNOS действует как индуцибельная форма NOS [13].

Активность сNOS в условиях физиологического покоя клетки постоянная и весьма низкая. Однако под воздействием таких биологически активных соединений, как ацетилхолин, брадикинин, серотонин, тромбин, АДФ, глутамат, стимулирующих вход Са²⁺ в клетку, ее кальцийзависимая активность повышается, что приводит к синтезу небольшого количества и выделению на короткое время NO, через цГМФ выполняющего в клетках-мишенях регуляторные функции [22, 38]. В то же время iNOS является кальцийнезависимой, и для ее синтеза необходима срочная экспрессия белка на уровне ДНК. Это происходит под влиянием иммуногенных и провоспалительных стимулов (эндотоксины, бактериальные липополисахариды, γ-интерферон и прочие цитокины). При этом соответствующие клетки (макрофаги, нейтрофилы, моноциты, фибробласты) продуцируют и выделяют огромное количество NO, который оказывает в этом случае мощное повреждающее действие на проникшие в организм чужеродные клетки и микроорганизмы, осуществляя, таким образом, защитную функцию [23, 33, 34]. 

Получить очищенную nNOS из мозга удалось после того, как была установлена ее кальмодулинзависимость [12,13]. Среди большого числа ингибиторов NOS наиболее известны нитро- и алкилпроизводные L-аргинина, т.е. структурные аналоги природного субстрата фермента (L-NAME, L-NNA и др.) [8]. Учитывая, что NO может играть патогенетическую роль при целом ряде патологических состояний нервной системы, в том числе ишемии, некоторые ингибиторы NOS стали объектом интенсивного изучения в качестве возможных нейропротекторов.

Описана группа производных 7-нитроиндазола [40]. Они селективно ингибируют nNOS, проявляя при этом антиноцицептивное и противосудорожное действие [41].

Одним из механизмов регуляции NOS является фосфорилирование   при участии ряда протеинкиназ: nNOS может фосфорилироваться цАМФ-зависимой, цГМФ-зависимой и Са²⁺-кальмодулинзависимой протеинкиназами и протеинкиназой С. При фосфорилировании активность фермента снижается [11]. В то же время способность протеинфосфатазы кальцийнейрина дефосфорилировать NOS приводит к повышению ее каталитической активности [18].

Методами иммуногистохимии и гибридизации in situ удалось детально изучить локализацию nNOS в мозге [12]. Местами ее локализации оказались в первую очередь глутаматергические гранулярные клетки и ГАМК-ергические корзинчатые клетки мозжечка, нейроны коры мозга и полосатое тело (в последних двух образованиях nNOS содержится в 1— 2% общей популяции нейронов). Необходимо отметить, что во всех нейронах, где обнаружена NOS, одновременно выявляется и другой фермент — NADPH-диафораза, окрашивание которого основано на реакции восстановления тетразолия в темно-синий преципитат формазана [17]. Важно, что одни и те же нейроны окрашиваются на NOS и NADPH-диафоразу, поскольку на этом факте основан метод идентификации nNOS.

Накопление возбуждающих аминокислот в синаптической щели вызывает гиперактивацию глутаматных NMDA-рецепторов, что обусловливает открытие Na⁺ - и Ca²⁺-каналов с последующим увеличением интрацеллюлярного потока кальция. Последний связывается с кальмодулином, который активирует NOS, катализирующую образование NO [24, 36]. В свою очередь NO стимулирует гуанилатциклазу с дальнейшим синтезом цГМФ, вызывающего различные внутриклеточные метаболические процессы, результат которых зависит от условий и функционального состояния нейрона [4].

Следует отметить, что в патофизиологических механизмах нарушения мозгового кровообращения принимает участие не только nNOS, но и еNOS и iNOS. Освобождение NO при острой церебральной ишемии может иметь как отрицательное, так и положительное влияние на исход гипоксического воздействия. Повышение активности еNOS вызывает нейропротективный эффект, вероятно, благодаря церебральному вазодилататорному действию NO, ингибированию агрегации тромбоцитов и адгезии эндотелиальных лейкоцитов [45]. Возможна также ретроградная блокада NMDA-рецепторов [37]. Негативное влияние обусловлено повышенным образованием свободнорадикальных продуктов: в комбинации с супероксидными радикалами NO образует токсический пероксинитрит.

Использование доноров NO и ингибиторов NOS при моделировании локальной ишемии ГМ и развитии инфаркта мозга приводит к неоднозначным и достаточно противоречивым результатам. При моделировании церебральной ишемии путем окклюзии средней мозговой артерии у мышей, лишенных гена еNOS, развивался обширный инфаркт [26]. Напротив, увеличение еNOS, способствующей повышению образования NO, при внутривенном введении субстрата еNOS — L-аргинина и донора NO — нитропруссида натрия приводит к уменьшению зоны инфаркта по сравнению с контрольными животными [28]. В то же время у мышей, генетически лишенных nNOS, объем инфаркта мозга в среднем на 38% меньше, чем у обычных мышей [25]. Применение селективного ингибитора nNOS — 7-нитроиндазола у крыс при моделировании локальной ишемии ГМ способствовало уменьшению объема инфаркта [16, 48]. В ряде работ приводятся данные о значительном нейропротективном эффекте доноров NO, комбинации L-аргинина и неселективного ингибитора NOS — L-NAME или перемежающейся реперфузии с предварительным введением L-NAME [32, 52]. Установлено, что NO вызывает уменьшение отека в течение раннего постишемического периода, но активизирует его формирование в поздний период после моделирования глобальной ишемии ГМ [49] . Вероятнее всего, NO может вызывать нейропротективный эффект на начальном этапе возникновения ишемии, однако проявлять нейротоксическое действие во время реперфузии [35].

В наших исследованиях показано, что локальная церебральная ишемия приводит к значительному ухудшению параметров массопереноса кислорода в коре ГМ и активации ПОЛ с частичной нормализацией прооксидантного звена в раннем постишемическом периоде. Предварительное, до ишемии ГМ, введение L-NAME в разных дозах не оказывало позитивного влияния на параметры транспорта кислорода в корковых отделах во время ишемии, улучшая динамику массопереноса кислорода через 2 ч от начала реперфузии при использовании L-NAME в дозе 10 мг/кг. При этом низкие дозы L-NAME угнетали, а высокие — активировали прооксидантные реакции во время ишемии. В постишемическом периоде при использовании L-NAME в дозе 10 мг/кг выявлена полная нормализация показателей ПОЛ, что коррелирует с динамикой параметров массопереноса кислорода. В то же время применение L-аргинина в дозе 20 и особенно 50 мг/кг улучшает тканевое дыхание и повышает скорость транспорта кислорода во время ишемии, что может свидетельствовать о влиянии NO не только на мозговое кровообращение, но и на процесс церебральной оксигенации. L-аргинин в условиях дефицита кислорода обладает умеренным прооксидантным действием, ингибируемым на стадии реперфузии [7].

На основании собственных экспериментальных данных и анализа литературы В.П. Реутов с соавт. [9] развивают представления о существовании цикла оксида азота в организме млекопитающих, состоящего из двух компонентов: NО-синтазных и нитритредуктазных реакций. В результате окисления NO образуются ионы NO₂^- , NO₃, а восстановление ионов NO₂^- до NO осуществляется в ходе нитритредуктазной реакции. По мнению авторов, дефицит кислорода является сигналом, который вызывает переход клеток на нитратно-нитритное дыхание с образованием NO. Вместе с тем имеются данные о том, что L-аргинин обладает противогипоксическим действием [5, 6]. При гипоксии резко усиливается утилизация L-аргинина, что, вероятно, отражает его усиленное использование при гипоксии в цикле трикарбоновых кислот [9, 47].

При моделировании церебральной ишемии, вызываемой перевязкой средней мозговой артерии у спонтанно гипертензивых крыс, показано, что синтез NO обратно зависимо коррелирует с образованием «агрессивного» кислорода (О₂^-). Дефицит образования NO в нейронах обусловлен интенсивностью образования молекул О₂^-, запускающего каскад реакций апоптоза [19].

Получены данные о том, что нейропротективный эффект L-аргинина или доноров NO снижается уже через 2 ч после моделирования церебральной ишемии, а внутривенное введение L-аргинина через 24 ч после создания ишемии ГМ приводит к увеличению объема инфаркта [51]. Этот эффект L-аргинина связан с появлением через 6—12 ч в ишемической пенумбре третьей изоформы NOS — iNOS [28 ].

Известно, что iNOS способствует отсроченным нейрональным повреждениям при инсульте. Так, у мышей, генетически лишенных iNOS, развивался значительно меньший по объему церебральный инфаркт после фокальной ишемии, чем у обычных мышей [29]. Следовательно, образование iNOS при церебральной ишемии отсрочено в отличие от еNOS и nNOS. iNOS — не конститутивный энзим, он продуцируется после стимуляции нейтрофилов цитокинами, что является следствием локальной ишемии [28]. Показано, что индукция iNOS нарастает через 12 ч от начала развития ишемии, достигает максимума через 48 ч и приближается к исходному уровню спустя 7 сут [31]. Таким образом, основной источник отсроченного синтеза NO в ишемизированном мозге — iNOS. Поздняя индукция iNOS объясняет не только ранний нейропротективный, но и последующий нейротоксический эффект L-аргинина, который является естественным субстратом для каждой из трех изоформ NOS.

Нейропротективный эффект селективного ингибитора nNOS — 7-нитроиндазола на модели локальной ишемии ГМ у грызунов был выявлен при его введении в первые 2 ч развития ишемии [39]. В то же время установлено, что nNOS играет большую роль в формировании ряда компенсаторных реакций при церебральной ишемии, осуществлении таких важных неврологических функций, как синаптическая пластичность и нейрональная сигнализация [27]. При исследовании неповрежденных кортикальных нейронов, расположенных в области пенумбры, было установлено, что их резистентность к ишемии, вызванной фокальным фототромбозом, связана с активностью nNOS и антиапоптотической защитой за счет белка Bcl-2 [10]. Мыши, генетически лишенные nNOS, вели себя беспокойно и агрессивно [43]. Не исключено, что этот негативный эффект может проявиться и у больных ишемическим инсультом при использовании селективного ингибитора nNOS. Ингибирование nNOS активирует также ядерный фактор-кβ, приводящий к индукции iNOS, что в свою очередь может усиливать тканевое повреждение при гипоксии ГМ [50]. Все это позволяет с известной долей осторожности прогнозировать применение селективных ингибиторов nNOS при ишемическом инсульте у больных.

Наиболее подходящей мишенью для фармакологической регуляции NО является iNOS, так как ее синтез активизируется спустя 12 ч после развития ишемии, а действие осуществляется в течение нескольких суток [31]. Установлено, что селективный ингибитор iNOS — аминогуанидин обладает дозозависимым нейропротективным эффектом: чем раньше его используют и чем выше доза, тем выраженнее уменьшение объема инфаркта мозга [15, 30].

Имеются сведения о том, что аминогуанидин ингибирует не только пути синтеза NO после моделирования острой церебральной ишемии. Так, он ингибирует полиаминоксидазу в мозге, которая после развития ишемии инициирует высвобождение высоких концентраций 3-аминопропанала, проявляющего нейротоксический эффект и индуцирующего апоптоз глиальных клеток. Показано, что аминогуанидин при пероральном и внутривенном введении безопасен и хорошо переносится пациентами [14]. Однако в настоящее время для лечения ишемического инсульта он широко не применяется. Исследования с целью получения четких доказательств нейропротективного действия аминогуанидина в клинике продолжаются.

Таким образом, резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что NO, синтезируемый в ранний период ишемического повреждения мозга (по некоторым данным, до 8 мин), обладает нейропротективным действием и препятствует запуску процессов апоптоза в нейронах, но в более поздние сроки проявляет нейротоксический эффект, зависящий от определенной изоформы синтазы в конкретной области мозга [2, 46].

Вполне логично допустить, что повышение активности еNOS при использовании доноров NO в комбинации с селективным ингибитором nNOS на ранней стадии и селективного ингибитора iNOS в более поздний (до 2 сут) период ишемического повреждения головного мозга может стать в недалеком будущем одним из важных направлений лечения ишемических инсультов у больных.

Литература 

1.       Болдырев А.А. // Биохимия. — 1995. — Т.60, № 9. — С.1536—1542.

2.       Гомазков О.А. Нейрохимия ишемических и возрастных патологий мозга: Информ.-аналит. издание. — М., 2003. — 200 с.

3.       Гуревич К.Г., Шимановский Н.Л. // Вопр. биологии, медицины и фармацевт. химии.— 2000. — № 4. — С.16—22.

4.       Крыжановский Г.Н. Общая патофизиология нервной системы: Руководство. — М.: Медицина, 1997. — 352 с.

5.       Милютина Н.П., Ананян А.А., Шугалей В.С. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. — 1990. — № 9. — С. 263—265.

6.       Могильницкая Л.В., Фан А., Баранова Н.Ю., Шугалей В.С. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. — 1992. — № 5. — С. 497—498.

7.       Нечипуренко Н.И., Антонов И.П., Гаврилова А.Р., Щербина Н.Ю. // News of Biomed. Sci. — 2001. — № 2. — С. 5—9.

8.       Раевский К.С. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. — 1997. — Т.123, № 5 . — С. 484—490.

9.       Реутов В.П., Сорокина Е.Т., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих.— М.: Наука, 1998. — 159 с.

10.     Bidmon H.J., Emde B., Kowalski T. et al. // J. Chem. Neuroanat. — 2001. — V. 22, N 3. — P. 167—184.

11.     Bredt D.S., Ferris C.D., Snyder S.H. et al // J.Biol. Сhem. — 1992. — V. 267. — P.10976—10981.

12.     Bredt D.S., Glatt C.E., Hwang P.M. et al. // Neuron.— 1991. — V. 7. — P.615—624.

13.     Bredt D.S., Snyder S.H. // Ann. Rev. Biochem. — 1994. — V. 63. — P. 175—195.

14.     Bucala R., Vlassara H. // Amer. J. Kidney Dis. — 1995. — V. 26. — P. 875—888.

15.     Cockcroft K.M., Meistrell M., Zimmerman G.A. et al. // Stroke. — 1996. —V. 27. — P. 1393—1398.

16.     Dalkara T., Yoshida T., Irikura K. et al. // Neuropharmacol. — 1994. — V.33. — P. 1447—1452.

17.     Dawson T.M., Bredt D.S., Fotuhi M. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1991. — V.88. — P. 7797—7801.

18.     Dawson T.M., Steiner J.P., Dawson V.L. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1993. — V.90. — P.9808—9812.

19.     Dobrucki L.W., Kalinowski L., Uracz W. et al. // J.Physiol. Pharm. — 2000. — V. 51, N 4, Pt 1. — P. 695—703.

20.     Faraci F.M., Brian J.E. // Stroke. — 1994. — V.25. — P.692—703.

21.     Fisher M. // Neuroscientist. — 1999. — V. 6. — P. 392—401.

22.     Forstermann U., Kuk J.E., Nakane M. // Naunyn.-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. — 1993. — V. 347. — P. R61.

23.     Forstermann H., Schmidt H.H., Pollock J.C. // Biochem. Pharmacol. — 1991. — V. 42. — P. 1849—1957.

24.     Hoffman D.J., Mc Gowan J.E., Marro P.J. et al. // Neurosci. Lett. — 1994. — V. 167. — P. 156—160.

25.     Huang Z., Huang P.L., Panahian N. et al. // Science. — 1994. — V. 265. — P.1883—1885.

26.      Huang Z., Huang P.L., Ma J. et al. // J. Cerebr. Blood Flow Metab. — 1996. — V. 16. —P. 981—987.

27.     Hudetz A.G., Shen H., Kampine J.P. // Amer. J. Physiol. — 1998. — V. 274. — P. H982—H989.

28.     Iadecola C. // Trends Neurosci. — 1997. — V.20. — P.132—139.

29.     Iadecola C., Zhang F., Casey R. et al. // J. Neurosci. — 1997. — V. 17. — P. 9157—9164.

30.     Iadecola C., Zhang F., Xu S. // Amer. J. Physiol. — 1995. — V. 268. — P.R 286—R 292.

31.     Iadecola C., Zhang F., Xu S. et al. // J. Cerebr. Blood Flow Metab. — 1995. — V. 15. — P. 378—384.

32.     Juliano B.A., Anderson R.E., Meyer F.B. // J. Neurosurg. — 1995. — V. 83, N 3. — P. 491—495.

33.     Kam P.C.A., Govender G. // Anaesthesia. — 1994. — V. 49. — P. 515—521.

34.     Knowies P.G., Moncada S. // Biochem. J. — 1994. — V. 298. — P. 249—258.

35.     Kuang P., Tao Y., Tian Y. // Tradit. Clin. Med. — 1996. — V. 16, N 3. — P. 224—227.

36.     Lipton S.A., Rosenberg P.A. // New Engl. J. Med. — 1994. — V. 330. — P. 613—622.

37.     Manzoni O., Prezeau L., Marin P. et al. // Neurol. — 1992. — V. 8. — P. 653—662.

38.     Marben P.A., Schappert H.T., Chen H.S. // FEBS Lett. — 1992. — V. 307. — P. 287—293.

39.     Mesenge C., Verrecchia C., Allix M. et al. // J. Neurotrauma. — 1996. — V. 13. — P. 209—214.

40.     Moore P.K., Wallace P., Gaffen Z. et al. // Brit. J. Pharmacol. — 1993. — V. 110. — P. 219—224.

41.     Mulsch A., Busse R., Mordvintsev P. et al. // Neuroreport. — 1994. — V. 5. — P. 2325—2328.

42.     Myers P.R., Minor R.L., Guerra R. et al. // Nature. — 1990. — V. 345. — P. 161—164.

43.     Nelson R.J., Demas G.E., Huang P.L. et al. // Nature. — 1995. — V. 378. — P. 383—386.

44.     Olanow C.W. // Trends. Neurosci. — 1993. — V. 6. — P. 439—444.

45.     O’Manony D., Kendall M.J. // Neurol. Neurosurg. Psychiatr. — 1999. — V. 67. — P. 1—3.

46.     Pelligrino D.A. // Neurosurg. Anesthesiol. — 1993. — V. 5. — P. 221—231.

47.     Reutov V.R., Sorokina E.G., Rodionov A.A., Korshunova T.S. // Structure and function of regulatory polypeptides. — Moscow, 1992. — P.67.

48.     Sorrenti V., Di Giacomo C., Campisi A. et al. // Neurochem. Res. — 1999. — V. 24, N 7. — P. 861—866.

49.     Strasser A., Yasuma Y., Stanimirovic D.B. et al. // Z. Gerontol. Geriatr. — 1999. — V. 32, N 1. — P. 33—40.

50.     Togashi H., Sasaki M., Frohman E. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1997. — V. 16. — P. 2676—2680.