Сhlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis — внутриклеточные бактерии, способные вызывать у человека различные по локализации воспалительные процессы, поражающие эпителий. Общепризнанна роль этих возбудителей в развитии воспалительного процесса урогенитального тракта, патологии беременности и в перинатальном инфицировании новорожденных. В связи с этим актуальными являются задачи достоверной диагностики и эффективного лечения урогенитальных хламидийно-микоплазменных инфекций [1, 4]. Быстро и качественно обнаружить Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum возможно с помощью молекулярно-биологического метода — полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей выявлять ДНК возбудителя в биологическом материале [2, 9].

Наряду с проблемой диагностики урогенитального хламидиоза и микоплазмоза до сих пор остаются дискутабельными подходы к лечению данных инфекций. В терапии воспалительных процессов урогенитального тракта, обусловленных Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis, используются антибактериальные препараты, воздействующие на синтез белка и ДНК возбудителя. Данными свойствами обладают тетрациклины (окситетрациклин, рондомицин, доксициклин), макролиды (эритромицин, рокситромицин, кларитромицин, азитромицин) и фторхинолоны (ципрофлоксацин, ломефлоксацин, пефлоксацин) [1]. Из-за особенностей биологии этих инфекционных агентов наиболее часто применяемые для лечения антибиотики тетрациклинового ряда и макролиды не всегда достаточно эффективны. Активное использование антибактериальных агентов в терапии различных воспалительных заболеваний привело к росту числа устойчивых микроорганизмов, что делает актуальным изучение феномена резистентности, а также методов определения устойчивости в клинических популяциях. Данные многочисленных исследований свидетельствуют о высокой распространенности устойчивых к тетрациклинам клинических штаммов микоплазм и уреаплазм, варьирующей от 10 до 40% для разных видов Mollicutes [8].

Механизмами формирования у микроорганизмов резистентности к антибактериальным агентам являются мутационные изменения или интеграция в геном нового генетического материала, несущего детерминанты устойчивости к антибиотикам [3]. Так, резистентность к препаратам группы тетрациклина определяется tet-M- и tet-O-детерминантами, которые обнаруживаются при изменении конформации рибосом, вследствие чего сродство препарата к местам узнавания на рибосоме падает. Эти детерминанты выявлены как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий и обеспечивают защиту клетки от тетрациклина путем изменения конформации рибосомы. Микроорганизмы могут приобретать гены устойчивости к тетрациклинам от грамположительной флоры человека. Предполагают, что конъюгативный перенос tet-M- детерминанты осуществляет транспозон Tn 916, обнаруженный в хромосомах бактерий родов Enterococcus, Streptococcus; перенос tet-O гена происходит благодаря наличию конъюгативных плазмид [10,11].

Устойчивость хламидий и микоплазм к макролидам определяется генами, детерминирующими синтез метилтрансфераз, которые способны изменять сайты распознавания антибиотиков — 23S рибосомальную РНК. Перенос генов резистентности возбудителям также осуществляют мобильные генетические элементы — транспозоны [10, 11]. Устойчивость к одному из препаратов групп макролидов и тетрациклинов указывает на нецелесообразность использования других антибиотиков этой группы ввиду перекрестной резистентности [3]. 

В последнее время технология ПЦР стала применяться не только для диагностики и оценки эффективности лечения, но и для выбора рациональной антибиотикотерапии. Использование ПЦР с целью определения антибиотикорезистентности актуально и для таких труднокультивируемых микроорганизмов, как хламидии и микоплазмы. Описаны праймеры и тест-системы, позволяющие определять наличие генов, детерминирующих устойчивость к тетрациклину и макролидам у целого ряда патогенных микроорганизмов [7, 8].

В нашей работе метод ПЦР использовался для диагностики в клинических пробах ДНК Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis, а также для исследования наличия в ДНК возбудителя фрагментов генов устойчивости к тетрациклинам (tet-M и tet-O) и макролидам (erm-генов).

Цель исследования — с использованием метода ПЦР установить частоту распространенности тетрациклин- и макролидоустойчивых Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis при воспалительных процессах урогенитального тракта у женщин.

Основную группу составили 75 женщин с диагнозом эндоцервицит. Длительность заболевания — от 3 мес до 7 лет. В контрольную группу вошли 25 практически здоровых женщин. Средний возраст обследованных — 30±5 лет. Материалом для исследования служили соскобы эпителиальных клеток из цервикального канала шейки матки и уретры.

ДНК из клинических образцов выделяли методом адсорбции на частицах двуокиси кремния в присутствии гуанидинатицианата натрия. Штаммы урогенитальных хламидий и микоплазм идентифицировали на основании анализа последовательностей гена 16S рРНК.

Для выявления штаммов урогенитальных микоплазм, устойчивых к тетрациклинам, применяли праймеры, амплифицирующие последовательности генов устойчивости к тетрациклинам tet-M и tet-O. С целью обнаружения микроорганизмов, устойчивых к макролидам, использовали праймеры к участкам ДНК, кодирующим консервативные нуклеотидные последовательности erm-генов, детерминирующих синтез метилтрансфераз.

Амплификацию ДНК осуществляли в многоканальном амплификаторе «Терцик МС2» («ДНК-Технология», Россия) с использованием диагностических наборов «Полимик», «Тетропол», «Эритропол» (НПФ «Литех»). Учет результатов производили методом электрофореза в 2% агарозном геле с регистрацией и документированием видеосистемой для регистрации гелей «Gel-Imager» («Петротерм», Россия) с помощью программы «Gel Explorer» на компьютере Intel Pentium-4. Положительным контролем наличия устойчивости возбудителей к антибиотикам группы тетрациклина являлся фрагмент ДНК размером 470 пар нуклеотидов. Положительным контролем наличия у микроорганизмов устойчивости к макролидам считался фрагмент ДНК размером 956 пар нуклеотидов.

Для подтверждения достоверности результатов выполнены параллельные исследования на антибиотикоустойчивость микроорганизмов в биологических образцах методом диффузии в агар с применением бумажных дисков (ДД).

В ходе исследования была определена частота распространения Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в группе пациенток с эндоцервицитами. Хламидии обнаружены у 12 (16%) обследованных женщин. ДНК Ureaplasma urealуticum выявлена у 19 (25,3%) пациенток. Положительный результат на Mycoplasma hominis зарегистрирован у 2 (2,6%) женщин.

Особенностью современного течения урогенитальных инфекций является частая ассоциация их друг с другом и с заболеваниями, вызванными прочими микроорганизмам [1, 8, 9]. При анализе видовой специфичности воспалительных процессов урогенитального тракта у женщин с эндоцервицитом мы установили, что наиболее часто обнаруживается сочетание   Ureaplasma urealуticum с Chlamydia trachomatis. У пациенток основной группы это сочетание выявлено в 18 случаях (24%) положительных результатов. Ureaplasma urealуticum в ассоциации с Mycoplasma hominis обнаружена у 8 (10,6%) обследованных пациенток гинекологического профиля. Сочетанное обнаружение Mycoplasma hominis и Chlamydia trachomatis отмечено также у 8 пациенток, что составило 10,6% от числа обследованных женщин с воспалением шейки матки. Таким образом, ассоциации Chlamydia trachomatis в виде микст-инфекций выявлены у 26 пациенток (34,6%). У 12 (16%) женщин данный возбудитель обнаружен в виде моноинфекции. Ведущая роль в этиологии анализируемых нозологических форм заболеваний принадлежит Ureaplasma urealуticum — 46,7% общего количества обследованных. В виде ассоциированных инфекций Ureaplasma urealуticum встречалась у 26 (34,6%) пациенток. Обнаружение Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis  и Ureaplasma urealyticum имело высокие значения критерия соответствия (Р<0,05) [5].

В контрольной группе (практически здоровые женщины) частота выявления этих микроорганизмов существенно отличалась: Chlamydia trachomatis и Mycoplasma hominis не обнаружены ни в виде моно-, ни в виде микст-инфекций, Ureaplasma urealyticum встречалась как моноинфекция у 3 (12%) пациенток.

Полученные данные свидетельствуют о широком распространении хламидиоза и микоплазмоза при воспалительном процессе урогенитального тракта, что сопоставимо с данными других авторов [1—3].

Анализ распространенности tet-генов показал, что в группе женщин с эндоцервицитами частота выявления у возбудителей фрагмента гена устойчивости к тетрациклинам составляла при хламидиозах 41,6%, при уреаплазмозах — 25%, при ассоциированной хламидийно-микоплазменной инфекции — 60%, хламидийно-уреаплазменной — 33,3%, мико-уреаплазменной — 25%. При анализе данных анамнеза установлено, что процент выявления tet-положительных возбудителей значительно выше после лечения антибиотиками группы тетрациклина. Полученные нами данные свидетельствуют о широкой персистенции tet-гена в клетках Ch.trachomatis, M.hominis и U.urealyticum, выделенных у пациенток с воспалительными процессами урогенитального тракта. Проанализированный в работе клинический материал позволяет утверждать, что присутствие tet-детерминант и формирование устойчивости к тетрациклинам сопряжено с лечением пациенток препаратами данной группы.

Методом ПЦР установлено, что частота распространения макролидоустойчивых Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis  и Ureаplasma urealyticum составляет 15,3%, а сочетания M.hominis и U.urealyticum — 14,2%. Следует отметить наличие устойчивости возбудителей к антибактериальным препаратам как группы тетрациклина, так и макролидов, что наблюдалось при хламидийно-микоплазменной микст-инфекции в 26,8%, при микоплазменно-уреа-плазменной — в 12,2% случаев.

При сопоставлении результатов ПЦР и метода ДД на устойчивость-чувствительность к тетрациклинам было установлено, что совпадение наблюдалось в 83% случаев. В 8,5% случаев расхождения результатов метод ПЦР выдал заключение «чувствителен», а ДД — «умеренно устойчив», еще в 8,5% случаев заключение ПЦР было «чувствителен», а ДД — «устойчив».

Совпадение результатов методов ДД и ПЦР при изучении устойчивости-чувствительности к макролидам наблюдалось в 86% случаев. Различие (14%) представлено в следующем: ПЦР выдал заключение «чувствителен», а ДД — «умеренно устойчив».

По мнению Г.Д. Серова и А.А. Сизова [6], в случае использования метода ДД из-за близкого расположения дисков по виду зон торможения роста микроорганизмов можно обнаружить взаимное влияние антибиотиков на инфекционные агенты, поэтому результаты определения чувствительности-устойчивости возбудителей искажаются. При проведении метода ДД у некоторых культур, определенных как чувствительные (по диаметру), при пересеве полужидкого агара из зон были выделены устойчивые клоны [5].

Полученные данные подтверждают сведения других авторов о широком распространении антибиотикоустойчивых штаммов урогенитальных микоплазм, что определяет необходимость проведения исследований на чувствительность-устойчивость микрофлоры к антибиотикам перед назначением терапии [7, 8, 10, 11].

Таким образом, ПЦР — высокочувствительный и специфичный метод выявления Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, а также определения устойчивости-чувствительности их к антибактериальным препаратам по сравнению с традиционными методами лабораторного анализа. Метод ПЦР оптимален для скринингового обследования населения и является одним из основных диагностических критериев в решении проблемы воспалительных заболеваний урогенитального тракта. Выявлять у возбудителей гены устойчивости к антибактериальным препаратам целесообразно перед проведением этиотропной терапии, а также в случаях длительно текущих, рецидивирующих урогенитальных хламидиозов и микоплазмозов, особенно при микст-инфекциях.